方法:肺高血圧はMCT(60mg/kg)をラット皮下に単回投与することにより誘発し(MCT処置群)、対照動物には同量の溶媒を投与した(対照群)。投与3週間後に左右外肺動脈を摘出し実験に供した。

　内皮細胞の組織学的所見:光学顕微鏡下における観察では、対照群とMCT処置群の肺動脈の内膜においては内皮細胞は内弾性板に付着しており内皮細胞の剥離、消失は観察されなかった。

　内皮依存性弛緩反応と細胞内cGMP量:内皮保持標本における受容体作動薬カルバコールによる内皮依存性弛緩反応はMCT処置群において有意に減弱していた。またカルバコールによる細胞内cGMP量の増加もMCT処置群において有為に減弱していた。MCT処置群肺動脈におけるカルバコールによる内皮依存性弛緩反応の減弱はL-アルギニンおよび活性酸素消去薬であるスーパーオキサイドディスムターゼの前処置によって変化しなかった。

　Ca²⁺イオノフォア、イオノマイシンによる内皮依存性弛緩反応、およびイオノマイシンによる細胞内cGMP量の増加もカルバコール刺激時と同様に有意に減弱していた。静止時における内皮保持標本の細胞内cGMP量はMCT処置群において少なかった。

　内皮細胞内Ca²⁺濃度:Fura-PE3を内皮細胞に負荷し、内皮細胞内Ca²⁺濃度([Ca²⁺]_i)を測定したところ、カルバコールによる内皮細胞の[Ca²⁺]_iの上昇は対照群と比較して、MCT処置群において小さかった。静止時の[Ca²⁺]_iは対照群、MCT処置群の間で差は見られなかった。

　eNOSの発現量:内皮保持肺動脈標本より採取したtotal RNAを用いて、定量的RT-PCRによってNOSのmRNA発現量について検討した。MCT処置群において、eNOSのRNAシグナルは対照群に比べて、より少ないサイクル数において出現した。一方、誘導型NO合成酵素(iNOS)およびGAPDHのRNAシグナルはMCT処置群と対照群で差がなかった。以上の結果から、MCT処置ラットの肺動脈内皮細胞においてeNOS発現量が増加していることが示唆された。

　血管のNO感受性:内皮剥離標本においてNOドナーであるニトロプルシド(SNP)の収縮抑制作用とcGMP蓄積作用を検討した。フェニレフリン収縮に対するSNPの最大抑制はMCT処置群において小さかった。一方、KCl収縮に対するSNPの最大抑制はMCT処置群において大きかった。内皮剥離標本の静止時におけるcGMP量は両群の間で差はなかった。SNP刺激によって時間依存性に細胞内cGMP量は増加した。SNP刺激によるcGMP量の増加は両群の間で差はなかった。

　以上の結果から、MCT処置群において血管平滑筋のNO感受性の低下は見られなかった。従って、MCT処置群において観察された内皮依存性弛緩反応の減弱および内皮依存性のcGMPの蓄積量の低下は内皮細胞におけるNO合成量の低下によることが示唆された。内皮細胞におけるNOの合成は[Ca²⁺]_iによって調節されており、[Ca²⁺]_iの増加はNO合成を促進する。MCT処置群の肺動脈においてみられたNO産生量の低下の機構の一つとして、内皮細胞の受容体が活性化されてもNOを合成するのに十分量の[Ca²⁺]_iの上昇が起こらず、NO合成量が減少している可能性が示唆された。また、[Ca²⁺]_iを十分に増やすイオノマイシンによる弛緩反応とcGMPの蓄積が低下していたこと、および静止時の[Ca²⁺]_iがMCT処置群と対照群の間で同程度だったにもかかわらずcGMP量がMCT処置群において少なかったことからeNOSのCa²⁺感受性の低下が起こっていること示唆された。

　以上の成績から、MCT誘発肺高血圧ラットにおいて内皮細胞内におけるCa²⁺増加の抑制とeNOSのCa²⁺感受性の低下が起こっており、この結果として起こるNO合成能の低下から内皮依存性弛緩反応の低下が起こっていることが示唆された。eNOS発現量が増加していたのはNO合成機構の抑制に対する代償機構としての可能性が考えられるが、上記の異常を補償し、NO合成能を完全に回復するには至っていないものと考えられた。

　肺動脈平滑筋の機能的変化について、内皮剥離標本を用いて検討を行った。MCT処置群の肺動脈において、非刺激時に自発性血管緊張度が観察された。この張力の大部分はL型Ca²⁺チャネル遮断薬、ベラパミルの投与によって抑制された。また、収縮張力と[Ca²⁺]_iの同時測定において、対照群の肺動脈ではベラパミルの投与によって収縮張力と[Ca²⁺]_iの減少は認められなかったのに対し、MCT処置群の肺動脈においてはベラパミルによって収縮張力と[Ca²⁺]_iは大きく抑制された。この血管緊張度はCl^-チャネル阻害薬であるDIDSによって抑制され、DIDSによる血管緊張度の抑制の後にベラパミルを投与しても、それ以上の抑制は見られなかった。

　以上の結果からCl^-チャネルの恒常的な活性化が細胞外へのCl^-イオンの排出を亢進しその結果おこる脱分極がベラパミル感受性のL-型Ca²⁺チャネルを活性化している可能性が示唆された。近年、一時的な血圧の増加が血管平滑筋細胞のCl^-チャネルを活性化し、細胞膜の脱分極によって、血管径が調節される機構が報告されている。従って、肺高血圧時の慢性的な血圧の上昇が恒常的なCl^-チャネルの活性化を引き起こすのかもしれない。Cl^-チャネルの血管病態への関与はこれまで明らかにされていないが、本研究の結果から、肺高血圧ラット肺動脈平滑筋細胞のCl^-チャネルの恒常的な活性化が自発性血管緊張度を引き起こしている可能性が示唆された。

　MCT処置群肺動脈における内皮細胞と血管平滑筋の相互作用を明らかにするために、内皮保持標本と内皮剥離標本における自発性血管緊張度の大きさを比較した。内皮保持標本における血管緊張度は、内皮剥離標本で見られた血管緊張度より小さかった。NO合成酵素阻害薬であるL-NMMAを投与したところ、内皮保持標本において、ゆっくりとした収縮が発生し、その収縮張力の大きさは内皮剥離標本における血管緊張度と同程度であった。L-NMMAによる収縮が一定になった後、ベラパミルを投与するとその収縮の大部分は抑制された。内皮剥離標本でL-NMMAによる収縮は見られなかった。

　以上の結果から、MCT処置ラット内皮剥離肺動脈において見られた血管緊張の大部分は、内皮保持標本においては内皮細胞由来のNOによって抑制されていることが明らかになり、内皮細胞由来のNO量は低下していたにも関わらず、そのNOは平滑筋の血管緊張度の大部分を抑制し、肺高血圧を緩和する方向に働いていることが示唆された。また、内皮細胞からのNOによって抑制されない残存する一部の自発性血管緊張度が肺高血圧の増悪の重要な因子として、肺高血圧の進行に関与する可能性が示唆された。

　本研究の結果から、MCT誘発肺高血圧ラット肺動脈において、内皮細胞からのNO合成量の低下が確認され、その機構に受容体作動薬による細胞内でのCa²⁺上昇の低下、およびNO合成系におけるCa²⁺感受性の低下が関与していることが示唆された。また、MCT誘発肺高血圧ラット肺動脈では自発性血管緊張度があること、その収縮は恒常的なCl^-チャネルの活性化による脱分極に伴うL型Ca²⁺チャネルを介したCa²⁺流入によるものであることが示された。一方、内皮細胞からのNO放出量は減少していたにもかかわらず、肺動脈の自発性血管緊張度の一部は抑制されていたことからNOは肺高血圧時にも血管収縮を抑制し、肺高血圧を緩和させる働きを維持していることが明らかになった。NO合成能の低下によって、血管収縮の抑制および細胞増殖抑制をはじめとする、NOの持つ抗高血圧作用が解除されることが、肺高血圧症の発生および悪化に関わっている可能性がある。おそらくは内皮細胞からのNO産生量の減少は肺高血圧症の発生要因の一つとして働き、平滑筋細胞におけるCl^-チャネルの開口による血管収縮が肺高血圧症の増悪因子として働いているのであろう。これら本研究の成果は今後の肺高血圧治療の展開に寄与するものと考えられる。

　肺高血圧はモノクロタリン(MCT)(60mg/kg)をラット皮下に単回投与することにより誘発し(MCT処置群)、対照動物には同量の溶媒を投与した(対照群)。投与3週間後に左右外肺動脈を摘出し実験に供した。

　1)内皮保持標本において、受容体作動薬、カルバコール、およびCa²⁺イオノフォア、イオノマイシンによる内皮依存性弛緩反応とcGMP量の増加はMCT処置群において有意に減弱していた。

　2)Fura-PE3を内皮細胞に負荷し、細胞内Ca²⁺濃度([Ca²⁺]_i)を測定したところ、カルバコールによる[Ca²⁺]_iの上昇は対照群と比較して、MCT処置群において小さかった。

　静止時の内皮細胞の[Ca²⁺]_iとcGMP量:静止時の[Ca²⁺]_iは対照群、MCT処置群の間で差は見られなかった。一方で、内皮保持標本における静止時のcGMP量はMCT処置群において少なかった。

　3)内皮保持肺動脈標本より採取したtotal RNAを用いて、定量的RT-PCRによってNO合成酵素(NOS)のmRNA発現量について検討した。MCT処置群において、内皮細胞型NOS(eNOS)のcDNAバンドは対照群に比べ、少ないサイクル数で出現した。一方、誘導型NOSのcDNAバンドは両群とも同じサイクル数で出現した。

　4)内皮剥離標本において、NOドナーであるニトロプルシド(SNP)によるKCl収縮に対する最大抑制はMCT処置群において大きかった。内皮剥離標本の静止時、およびSNP刺激時のcGMP量は両群の間で差はなかった。

　以上の成績から、MCT処置群において血管平滑筋のNO感受性の低下は認められず、MCT処置群において観察された内皮依存性弛緩反応の減弱および内皮依存性のcGMP蓄積量の減少は内皮細胞におけるNO合成量の低下によることが示唆された。eNOS発現量はむしろ増加していたが、上記の異常を補償し、NO合成能を完全に回復するには至っていないものと考えられた。

　MCT処置群の内皮剥離肺動脈において、L型Ca²⁺チャネル遮断薬、ベラパミルによって大部分が抑制される自発性血管緊張度が非刺激時においても観察された。収縮張力と[Ca²⁺]_iの同時測定において、ベラパミルは[Ca²⁺]_iの減少を伴って、この血管緊張度を抑制した。この血管緊張度はCl^-チャネル阻害薬であるDIDSによっても抑制され、DIDSによる血管緊張度の抑制の後にベラパミルを投与しても、それ以上の抑制は観察されなかった。

　以上の成績からCl^-チャネルの恒常的な活性化が細胞外へのCl^-イオンの排出を亢進しその結果おこる脱分極がベラパミル感受性のL型Ca²⁺チャネルを活性化し、Ca²⁺流入を引き起こしていた可能性が示唆された。

　MCT処置ラット肺動脈において、内皮保持標本の血管緊張度は、内皮剥離標本で認められた血管緊張度より小さく、NO合成酵素阻害薬であるL-NMMAによって、収縮張力が発生し、その収縮張力の大きさは内皮剥離標本における血管緊張度と同程度であった。

　以上の成績から、血管緊張度の大部分は、内皮保持標本においては内皮細胞由来のNOによって抑制されており、内皮細胞由来のNO量は減少していたにも関わらず肺高血圧を緩和する働きを維持していることが示唆された。

　本研究の結果から、MCT誘発肺高血圧ラット肺動脈において、受容体活性化後の[Ca²⁺]_i上昇の抑制、およびNO合成系におけるCa²⁺感受性の低下に起因すると思われる内皮細胞のNO合成能の低下と平滑筋細胞の恒常的なCl^-チャネルの活性化による脱分極に伴うL型Ca²⁺チャネルからのCa²⁺流入に起因する自発性血管緊張度の亢進が明らかになった。これらの知見は学術上の重要性は言うに及ばず、肺高血圧という難治性疾患の病態管理・治療法の開発にも役立つ応用性の高い研究と考えられる。よって、審査委員一同は本論文が博士(獣医学)の学位論文として価値あるものと認めた。