ロイコトリエンD₄(Leukotriene D₄;LTD₄)は、炎症や気管支喘息等のアレルギー性疾患に深く関与していると推定される分子量497の生理活性脂質である。LTD₄の持つ生理活性は多様であり、細胞膜上LTD₄受容体は3量体型GTP結合タンパク質と共役した7回膜貫通型タンパク質であると推定されているにもかかわらず、細胞膜上LTD₄受容体は未だにタンパク質精製やcDNAクローニングに至っておらず、受容体を介した細胞内情報伝達機構の詳細な解析も行われていない。

　以上の点を踏まえて、本研究では単球・マクロファージとしての性格を有しているヒト白血病細胞株THP-1細胞を材料にして、細胞膜上LTD₄受容体を介した細胞内情報伝達機構の解析を行ったので、ここに報告する。

　*THP-1細胞の細胞膜画分に於けるLTD₄の結合活性を測定した。解離定数(K_d)は1.8nM、結合サイトの最大数(B_max)は31fmol/mg proteinであった。又、THP-1細胞にLTD₄を加えたところ、濃度依存的に一過的で素早い細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が観察された。100nMのLTD₄で刺激した場合、細胞内カルシウムイオン濃度は定常状態に比べて約250nM上昇した。LTD₄は濃度依存的に、フォルスコリンで誘導したcAMPの蓄積を阻害した。カルシウムレスポンスやcAMPの濃度減少については、細胞を予めLTD₄受容体の特異的アンタゴニストで前処理することによっていずれも消失した。これらの実験結果から、THP-1細胞に於いてLTD₄受容体が機能しており、カルシウムレスポンスやcAMP系へのシグナルは細胞膜上LTD₄受容体を介するものであることが明らかになった。

　*THP-1細胞を100nM LTD₄で刺激すると、時間依存的にMAPキナーゼ(Erk2)が活性化されていることが観察された。MAPキナーゼ活性化のLTD₄のEC₅₀値は約0.1nMであり、1nM以上の濃度では飽和していることが判明した。この活性化もLTD₄受容体の特異的アンタゴニストの前処理によって完全に阻害された。以上の実験結果から、LTD₄によって引き起こされるMAPキナーゼの活性化はLTD₄受容体を介するものであることが明らかになった。

　*LTD₄によって引き起こされるMAPキナーゼの活性化に与える種々の阻害剤の効果を検討した。THP-1細胞を百日咳毒素(pertussis toxin;PTX)で終夜培養すると、LTD₄によるMAPキナーゼの活性化は僅かに阻害された。細胞内カルシウムイオンのキレーターであるBAPTA/AMで前処理すると、LTD₄によるMAPキナーゼの活性化は約半分程度にまで阻害された。プロテインキナーゼC(PKC)の阻害剤であるGF109203Xやスタウロスポリンで前処理したところ、LTD₄によるMAPキナーゼの活性化は大部分阻害された。又、THP-1細胞をホルボールエステルである12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate(TPA)で終夜培養し、細胞内のPKCをダウンレギュレーションさせると、LTD₄によるMAPキナーゼの活性化は完全に阻害された。これらの実験結果から、LTD₄受容体を介したMAPキナーゼの活性化はPKCの活性に依存した経路によって引き起こされることが明らかになった。

　*LTD₄によるMAPキナーゼの活性化にはどの種類のPKCが関与しているのかを検討した。THP-1細胞に於いて定常状態ではほとんど全てのPKCとPKCが細胞質画分に存在していたが、100nM LTD₄刺激後5〜10分で細胞質に存在したPKCとPKCが細胞質画分から細胞膜画分へと移行していることが明らかになった。

　*LTD₄によるMAPキナーゼの活性化にRaf-1が関与しているか否かについて検討を加えた。THP-1細胞をLTD₄で刺激後、細胞ライセートを抗Raf-1抗体で免疫沈降し、それらに対して外来性の基質タンパク質を加えてin vitro kinase assayを行ったところ、定常状態に比して約2倍の活性化能(燐酸化能)を有していることが明らかになった。細胞をTPAで終夜培養してから同様のアッセイを行ったところ、Raf-1の免疫沈降物は基質を燐酸化することは出来なかった。以上の実験結果から、LTD₄によるMAPキナーゼの活性化には、PKCによるRaf-1の活性化が重要な役割を担っていることが明らかになった。

　*最後に、THP-1細胞に於いてLTD₄が走化現象を引き起こすことを確認した。その極大濃度は30nMであった。細胞を予めPTXで前処理しておくと、この走化現象は完全に阻害された。これらの実験結果から、LTD₄による細胞の走化現象はPTX感受性の機構に依存して起こることが明らかになった。

　THP-1細胞は機能的なLTD₄受容体を発現し、それはPTX感受性(Gi様3量体GTP結合タンパク質)とPTX非感受性(Gq様3量体GTP結合タンパク質)の両方に共役していることが本研究により明らかになった。LTD₄はGq様分子からPKC、Raf-1を介してMAPキナーゼ(Erk2)の活性化を引き起こし、一方走化現象はGi様分子によって引き起こされることが示された。これを模式図に表すと下図のように表される。本研究の実験結果から、炎症時に於けるLTD₄の多様多彩な生理作用の一部を説明出来るものと考えられる。THP-1細胞はLTD₄による細胞内情報伝達機構の解析に有用であるのみならず、細胞膜上LTD₄受容体の精製やcDNAクローニングにも有用であると考えられる。

図表