ロイコトリエンB₄(LTB₄)は強い白血球活性化能(走化性、内皮細胞への接着、スーパーオキシドの産生、リソソーム酵素の放出)をもち、生体防御と炎症惹起に関与している生理活性脂質である。

　当初、LTB₄は白血球で産生され、白血球で代謝されるものと考えられていたが、尋常性乾癬に羅患した皮膚や、糸球体腎炎の腎臓から高濃度のLTB₄が検出されるなど、本物質は白血球以外の臓器でも産生されていることが報告された。実際、モルモットおよびヒトにおいてLTB₄産生に関与するLTA₄水解酵素(LTA₄H)の臓器分布を調べた研究によると、肺、小腸、腎臓、肝臓などの実質臓器に強い活性とその酵素タンパク質の存在が明らかにされた。このことは炎症部位への白血球の遊走と活性化に臓器で産生されたLTB₄が何らかの役割を果たしていることを示唆している。

　LTB₄の不活性化経路に関してはヒトにおいて2つの経路が知られている。1つはLTB₄の主な産生臓器と考えられている白血球における酸化系である。この経路では、LTB₄の20位の炭素がチトクロムP450に属する酵素であるLTB₄20-hydroxylaseによって水酸化され、さらに別の酵素によりカルボキシル化され、次第に親水性の物質に変換されて生理活性を失う。

　実質臓器におけるLTB₄の代謝は、Kaeverらによりヒト腎臓の培養細胞を、またKumlinらによりヒト気管支を用いて示された。いずれの研究においても、酸化系とは異なる物質への変換が報告されたが、代謝物の構造や、代謝を司る酵素の本態は不明であった。

　本研究室において、LTB₄のブタ腎臓における代謝産物の構造を質量分析やNMRにより解析したところ、12-keto-LTB₄および10,11,14,15-tetrahydro-12-keto-LTB₄であることがわかり、酸化系とは異なる代謝経路が存在することが明らかになった。この反応系の初発酵素がLTB₄12-水酸基脱水素酵素(LTB₄12HD)であり、LTB₄を基質として12-keto-LTB₄を産生する。

　LTB₄12HDは、本研究室においてブタ腎臓より精製され、部分アミノ酸配列をもにcDNAが単離された。またヒトの本酵素のcDNAクローニングも行われ、腎臓と肝臓に高い発現が認められた。その後、ウサギの小腸の成熟過程で発現誘導されるAdRab-Fタンパク質や、ラットの肝臓において抗ガン剤であるdithiolethioneで誘導されるDIG-1タンパク質のクローニングが報告され、LTB₄12HDと高い一次構造上の相同性を示したことから、これらは同一の酵素であると考えられている。

　モルモットはLTB₄産生能が高く、LTA₄Hの分布なども調べられでおり、アレルギー性炎症のモデル動物としてよく使われる動物である。以前、共同研究者らにより、モルモット腎臓のホモジネートにおいて10-100倍程度高い比活性をもつタンパク質の存在が確認されていたが、この酵素はタンパク化学的な精製が困難で、単一標品への精製を行うことができなかった。本研究においては、分子生物学的な手法を用いLTB₄12HDのモルモットオルソローグの単離を試み、リコンビナントタンパク質を用いて、その酵素学的性質の検討や、抗体を用いた免疫組織学的検討を行った。また、米国のグループで報告されたように、本酵素がプロスタグランジン(PG)の代謝にも関与している可能性を検討した。

　モルモット肝臓から抽出したpolyA⁺RNAより逆転写酵素を用いてLTB₄12HDのcDNAを得た。これを鋳型にして、ブタ、ヒト、ウサギ酵素cDNAの相同性の高い塩基配列領域をもとに作成したプライマーを用いて、PCRを行った。増幅された750bpのDNA断片のシークエンスを行い、ブタのLTB₄12HDと高い相同性を示すことを確認した。これをプローブとしてモルモットの肝臓から作成したcDNAライブラリーをスクリーニングし、全長と思われるcDNAクローンを単離した。全長は2,188bpであり、タンパク翻訳領域(ORF)はブタ酵素と同じ長さの987bpで329個のアミノ酸をコードしていた。ブタ酵素との同一性はORFの塩基配列で80%、アミノ酸配列で78%であった。

　次に全長のcDNAをプローブとしてモルモット各臓器のLTB₄12HD mRNAの分布をノザンブロッティングにより調べた結果、小腸に強く発現しており、肝臓、腎臓、大腸にも発現が見られ、ヒトと異なる分布が示された。さらに、モルモット酵素をグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質として大腸菌に発現させ、グルタチオンセファロースカラムにより精製して、酵素学的な解析を行った。LTB₄に対するK_m値は91M、V_maxは1.7nmol/min/mg proteinであった。一方、15-keto-PGE₂に対するK_m値は35M、V_maxは330nmol/min/mg proteinであり、精製酵素は15-keto-PGE₂をより良い基質とする事も明らかとなった。リコンビナントの酵素でウサギを免疫することにより、本酵素に対するポリクローナル抗体を作成した。この抗体を抗原結合カラムで精製した後、免疫組織化学染色を行った結果、腎臓では集合管の上皮細胞と腎杯の移行上皮細胞に、小腸では絨毛(特に絨毛先端部)に、肺では肺胞全体と気管支軟骨細胞に発現を認めた。

　本酵素は種間でのアミノ酸配列(塩基配列)の同一性が高いにも関わらず、基質と思われるLTB₄に対する触媒活性がブタ酵素とかなり異なっていた。何らかの活性化の機序が存在する可能性があるが詳細は不明である。また本酵素は15-keto-PGE₂をより良い基質とするdual functional enzymeであることも明らかとなった。

　本酵素の免疫組織学的な検討から、小腸の絨毛先端に高い発現が認められた。以前に、同じ部位にLTA₄Hが発現していると報告されていることから、この部位においてLTB₄が合成され、分解されていると考えられる。この知見から腸炎などの炎症時に速やかにLTB₄が合成されて白血球が遊走されてくる一方で、同部位においてLTB₄が分解されると考えられる。腎臓においてLTA₄Hの強い活性が報告されているが、詳しい組織における局在は報告されていない。しかし集合管や腎杯の上皮細胞にLTB₄12HDの著しい局在化を認めることより、感染の起こりやすい腎盂、乳頭部でのLTB₄の過剰発現による組織傷害を防ぐ役割などが、もしくは糸球体より尿中に排泄されたLTB₄が集合管を通過する時に最終的に分解される可能性も考えられる。また、腎臓はPGを豊富肺では軟骨細胞や肺胞全体に発現が認められた。肺はPGの主な代謝組織であることが知られている。腎臓や肺での発現は、これらの組織でPGの不活性化に関与している可能性が考えられた。また、気管支軟骨細胞での発現はPGの骨代謝における役割と関連している可能性も示唆される。

　以上、本研究においてはモルモットのLTB₄12HDのcDNAクローニングを行い、リコンビナントタンパク質を用いた酵素学的検討を行った。また、抗体を作成し免疫組織化学的な検討を行った。モルモット本酵素のcDNAクローニング、発現、ポリクローナル抗体の作成と免疫組織化学的所見はいずれも新しい知見である。