従来の細胞内シグナル伝達の研究では、細胞をサイトカイン等で刺激した後にその抽出液を調製し、シグナル因子の活性化を解析する(以下、これをin vivo系と呼ぶことにする)。それに対してin vitro系では、未刺激の細胞から細胞膜を含む抽出液を調製し、試験管内でリガンドに依存したシグナル因子の活性化を誘導する。これまでに、このようなin vitro系を用いたSTATファミリーの転写因子に関する研究がいくつか報告されている。そこで、GM-CSFによるSTAT5の活性化を指標に、in vitro系の開発における条件検討を行った。

　ヒトGM-CSFレセプターを発現させたマウスIL-3依存性細胞株BA/F3から、細胞膜と細胞質画分を含む無細胞抽出液を調製し、この抽出液にヒトGM-CSFを添加してin vitroでの刺激を行った。その後、-カゼイン遺伝子のプロモーター中のSTAT5結合配列をプローブに用いてゲルシフト解析を行い、STAT5のDNA結合能を指標にSTAT5の活性化を調べた。その結果、チロシンホスファターゼ阻害剤sodium orthovanadate、セリン/スレオニンホスファターゼ阻害剤sodium fluoride、およびATP存在下でGM-CSF依存的に、STAT5のDNAへの結合が誘導されることを見いだした。そこで、このin vitro系でのGM-CSFによるSTAT5の活性化が、in vivo(細胞をGM-CSFで刺激した場合)の反応を再現できているかどうか検討を行った。ヒトGM-CSFレセプターを発現していないBA/F3細胞から調製した抽出液では、ヒトGM-CSF添加によるSTAT5の活性化はみられなかった。従って、in vitroでのSTAT5の活性化は、発現させたヒトGM-CSFレセプターを介して誘導されていると考えられる。また鎖細胞内領域のすべてのチロシン残基をフェニルアラニンに置換した変異型鎖(Fall)を発現したBA/F3細胞の抽出液では、in vivoでの結果と同様、GM-CSFによるSTAT5の活性化が著しく減少していた。さらに、ヒトGM-CSFレセプター(野生型)を発現させたBA/F3細胞の抽出液に、GM-CSFレセプター鎖のbox1/box2領域に対する抗体を添加すると、GM-CSFによるSTAT5の活性化が阻害された。これらのことから、in vitro系でのSTAT5の活性化には、in vivo系と同様に鎖のチロシン残基とbox1/box2領域が関与していることがわかった。また抗リン酸化チロシン抗体の添加によりSTAT5の活性化が阻害されたことから、STAT5の活性化の過程に、チロシンリン酸化と、それを介した分子間相互作用が関与していると考えられる。

　JAK2とSTAT5は、チロシンリン酸化により活性化されることが知られている。in vitro系でのJAK2とSTAT5のチロシンリン酸化を調べると、いずれもGM-CSF依存的に誘導されていることがわかった。さらに、このin vitro系における他のシグナル因子の活性化の解析を行った。in vivo系では、GM-CSFによりチロシンホスファターゼSHP-2のチロシンリン酸化、およびそれにともなうGrb2/Ashとの結合が引き起こされ、これらの事象はRas/Raf/ERK経路の活性化につながると考えられている。in vitro系においては、GM-CSF依存的にSHP-2のチロシンリン酸化の誘導がみられたが、SHP-2とGrb2/Ashの結合やその下流のキナーゼRaf-1の活性化はみられなかった。

　GM-CSFによるSTAT5の活性化機構について、in vitro系を用いてさらに解析を行った。まず、BA/F3細胞の抽出液を膜画分と細胞質画分に分画し、それぞれの画分でGM-CSFによるJAK2とSTAT5の活性化を検討した。膜画分ではJAK2のリン酸化は誘導されたが、STAT5の活性化はみられなかった。一方、細胞質画分ではJAK2、STAT5いずれの活性化も誘導されなかった。膜画分と細胞質画分を再び混ぜ合わせてGM-CSFを添加すると、STAT5を活性化することができた。STAT5は主に細胞質画分に局在することから、GM-CSFにより膜上でJAK2とGM-CSFレセプターの活性化がおこり、STAT5が細胞質から膜上に引き寄せられて活性化がおこると考えられる。

　これまでの鎖変異体を用いたin vivo系での解析から、STAT5の活性化には鎖細胞内領域のチロシン残基が重要であることが明らかになっている。鎖細胞内領域のすべてのチロシン残基をフェニルアラニンに置換したFall変異体では、STAT5の活性化のレベルは野生型に比べて極めて低いが、Fallに個々のチロシン残基を1つあるいは2つ戻した一連の変異体ではいずれもFallに比べて強いSTAT5の活性化が誘導される。STAT5は、チロシン残基にリン酸化依存的に結合するSH2ドメインを有していることから、鎖のチロシン残基がリン酸化されることによりSTAT5の結合部位として機能すると考えられているが、このことは直接には示されていない。そこで、鎖細胞内領域のチロシン残基を含む合成ペプチドを用いて、鎖のチロシン残基のSTAT5活性化における役割について検討を行った。鎖細胞内領域に存在する8カ所のチロシン残基それぞれについて、チロシンリン酸化型と非リン酸化型の合成ペプチドを作製し、BA/F3細胞の抽出液に添加してin vitro系でのSTAT5の活性化に対する影響を検討した。その結果、GM-CSF刺激前にペプチドを添加すると、すべてのリン酸化ペプチドにおいて、STAT5のDNA結合の阻害がみられた。一方、非リン酸化ペプチドでは阻害はみられなかった。これらのリン酸化ペプチドによるSTAT5のDNA結合の阻害は、GM-CSF刺激後にペプチドを添加した場合にもみられた。STATのDNA結合には、チロシンリン酸化部位とSH2ドメインを介した二量体形成が必要であるが、SH2ドメインに結合するリン酸化ペプチドの添加により、一度形成された二量体が解離しDNA結合が阻害されることが報告されている。従って、GM-CSF刺激後のリン酸化ペプチド添加ではSTAT5のチロシンリン酸化は阻害されず、DNA結合のみが阻害されている可能性が考えられた。そこでSTAT5のチロシンリン酸化について解析すると、予想された通り、リン酸化ペプチドをGM-CSF刺激前に添加した時はSTAT5のチロシンリン酸化が阻害されたが、GM-CSF刺激後に添加した時は阻害されなかった。GM-CSF刺激前のリン酸化ペプチド添加によるSTAT5のチロシンリン酸化の阻害は、STAT5のリン酸化に必要な鎖への結合を、ペプチドがSTAT5に結合することにより阻害するためであると考えられる。またGM-CSF刺激後、すなわちSTAT5がチロシンリン酸化を受けた後の、リン酸化ペプチドによるSTAT5のDNAへの結合の阻害は、リン酸化ペプチドがSTAT5のSH2ドメインに結合し二量体形成を阻害することによると考えられる。さらに、これらのペプチドをビーズに結合させ、BA/F3細胞の細胞抽出液からのpull down assayを行うと、すべてのリン酸化ペプチドにおいてSTAT5との結合がみられた。以上の結果から、鎖のチロシン残基がGM-CSFの刺激によりリン酸化を受け、STAT5の結合部位として機能すると考えられる。