脳・神経系の機能は、精密な神経回路網の形成と密接に関連している。脊椎動物の脳・神経系は高度に組織化され、複雑に絡まった神経細胞のネットワークから構築されており、神経細胞から個体そのものに至るまでの階層的構造を反映した、様々なレベルで解析が行われている。しかし、生体内における脳・神経系の機能の分子機構を明らかにするためには、個体を用いた解析が重要であると考える。なぜなら、脳・神経系の機能そのものが、生体内での回路構造や生理的環境に依存していると考えられるからである。

　一方、遺伝学は様々な生命現象のメカニズムを深く理解する上で非常に有力な手法である。遺伝学的手法はDNA配列の相同性や遺伝子の発現パターンに依存することなく、変異によって失活する遺伝子産物の機能を個体の表現型として観察できる、機能的研究方法であるといえる。事実、いくつかの優れたモデル生物で、遺伝学的手法を用いてこれまでの多くの新たな遺伝子が単離され、様々な生物学的現象の分子機構が明らかにされつつある。

　硬骨魚類ゼブラフィッシュは脊椎動物の脳・神経系の形成、機能を解析する上で優れたモデル生物である。ゼブラフィッシュは遺伝学的解析に適したいくつかの特性を備えている。近年、2つのグループによってN-ethyl-N-nitrosourea(ENU)を用いた大規模な変異体作成とスクリーニングが行われ、興味深い表現型をもつ多数の変異体が単離されている。しかし変異遺伝子のクローニングに関しては、既に報告されたいくつかの例を除いて、まだほとんどが実現されていない。なぜなら、ENUは点突然変異を優先的に引き起こす変異源であるため、変異部位の同定と変異遺伝子の単離には多大な時間と労力を要するからである。従って、ゼブラフィッシュを用いて脳・神経系の形成や機能に関わる遺伝子を系統的に探索していくためには、より簡便な遺伝子クローニングの手法を確立する必要があった。

　以上ような背景から、当研究室においてゼブラフィッシュを用いた新たな変異体作成法が確立された。変異源4,5’,8-trimethylpsoralen(TMP)は、Escherichia coliやCaenorhabditis elegansで比較的小さな欠失変異を引き起こすことが報告されている。安藤らにより、TMPはゼブラフィッシュにおいても変異源として有効に作用し、高頻度で変異を引き起こすことが示された。このことは、TMPが大規模な変異体作成をも行える有力な変異源であることを示唆している。また、欠失変異を引き起こし得るというTMPの作用特性は、変異部位を同定しさらには変異遺伝子を単離する上で、有用なマーカーをもたらす可能性があった。本研究では、TMP変異法によって単離されたゼブラフィッシュ変異体j12を用い、変異原因遺伝子をクローニングするための方法論の確立を行った。

　以上の結果を踏まえると、GDRDAを用いた手法は、従来のポジショナルクローニングの手法よりも迅速に全ゲノム中から連鎖マーカーを単離し変異部位を同定することができる、より効率的な方法であると考える。この新たな手法は、以下に述べる変異遺伝子をクローニングする際のゼブラフィッシュにおける問題点を克服している。第一の問題点として、ゼブラフィッシュ遺伝的マーカーの密度の低さが上げられる。既存の遺伝的地図上のマーカーは、染色体歩行を行うには遺伝的距離が離れ過ぎているため、独自に連鎖マーカーを単離しなければならない。第二に、従来のポジショナルクローニングで連鎖マーカーの検索に用いられるAFLPやrandom-amplified polymorphic DNA(RAPD)法は、全ゲノムの検索に非常に多くのプライマーを必要とする上、ゼブラフィッシュ近交系ABのゲノム中に内在する非連鎖の多型をも検出してしまう可能性がある。一方、GDRDAは既存の遺伝的地図に依存せず、変異部位に緊密に連鎖したマーカーのみを単離することができる方法である。従って、GDRDA法はTMP変異法だけではなく、ENU変異法による変異遺伝子クローニングにおいても十分に有用である。さらにTMP変異法によって得られた変異体の場合、GDRDA法により変異部位由来の断片を直接獲得することができる可能性もある。以上の点を考慮すると、GDRDAを用いた変異遺伝子クローニングの手法は、ゼブラフィッシュにおいて脳・神経系の発生や機能に必須な遺伝子を系統的に単離していく上で非常に有効な手段であると考える。