最近、ATF-2のb-ZIP領域がATF-2自身のN端領域と分子内で結合していることが報告された。この分子内結合によりN端に存在するATF-2の転写活性化領域はマスキングされているためにATF-2は不活性化された状態となっている。しかし、どのようにしてこの分子内結合がはずれてATF-2が活性化状態になるのかについては不明であった。本研究によりco-activatorとして知られているCBPがATF-2のb-ZIP領域に結合することによってATF-2の分子内結合をはずしてATF-2を活性化型にしていることが明らかになった。CBPはもともとPKAによってリン酸化されたCREBに特異的に結合しCREBの転写活性化能を上昇させる分子として同定された。さらにCBPはTFIIB,RNA pol IIなどの基本転写因子と相互作用することによってCREBと基本転写因子とをつなぐbridgeの役目を担っていることが示唆された。その後の解析によりCBPはCREBだけでなく様々な転写因子と結合し、細胞周期、細胞増殖、分化、発生などの多くのシグナル伝達系に深く関わっていることが示された。さらに最近CBPがhistone acetyltransferase活性を持ちクロマチンのremodelingに関わっていることがいくつかのグループより報告されている。

　私は、CBPがb-ZIP family memberであるCREB,c-Jun,JunB,ATF-4などのco-activatorとしても機能していることから、同じb-ZIP familyに属するATF-2とCBPとの関係について実験を行ったところ、CBPはATF-2とも結合しATF-2のco-activatorとしても機能していることが明らかになった。さらにCBPはATF-2のb-ZIP領域に結合することによってATF-2の分子内結合を解除していることが解明された。また、EIA13SについてもATF-2の分子内結合の解除に関してCBPと同様の効果があることが分かった。本研究によりATF-2がどのようなメカニズムで不活性型から活性型になるのかが明らかとなった。

TGF-シグナル伝達系におけるATF-2の機能

　TGF-はactivin,BMPを含むTGF- superfamilyの一種であり、細胞の増殖、分化、接着などの制御に関連し様々な生理作用を示すサイトカインである。TGF-のシグナル伝達系に関しては近年、Smad,TAKという2種類の細胞内シグナル伝達物質の発見により飛躍的に進歩している。TGF-の受容体にはTypeI,TypeIIの2種類の膜貫通型セリン/スレオニンキナーゼが知られている。TGF-が受容体に結合するとTypeI,TypeII receptorは細胞表面で複合体を形成する。さらにTypeII receptorがTypeI receptorのGS領域をリン酸化することによってTypeI receptorが活性化し細胞内にTGF-のシグナルが伝えられていく。活性化したTypeI receptorがどのようにシグナルを下流に伝えるのかについては現在までにSmad pathway,TAK pathwayという2種の異なる経路の存在が報告されている。

　TAK1は新規のMAPKKKに属する分子として同定され、そのキナーゼ活性はTGF-によって上昇することが示されている。活性化したTypeI receptorはまず、TAK1のactivatorであるTAB1にシグナルを伝え、TAB1によって活性化したTAK1がMKK3/4/6→p38へとkinase cascadeを誘導していく。TAK1経路が最終的に核内のどんな因子にシグナルを伝達しているのかについては現在までは不明である。

　一方、Smadは、DrosophilaにおいてmammalのBMP2/4に相当するdppの下流因子としてgenetic screeningによって得られたDrosophila Madのmammmalian homologueである。Smad3は活性化したTypeI receptorによって直接的にそのC末端がリン酸化される。リン酸化されたSmad3はactivin,TGF-,BMPシグナルの共通のmediatorであるSmad4と複合体を形成し核内に移動する。核内においてSmad complexは核内転写因子と結合しTGF-のtarget geneの誘導を引き起こすことが予想されるが標的核内因子については現在までにほとんど知られていない。

　以上のようにTAK,Smad両経路の存在は報告されているが、この2つの経路の関係や、核内標的因子などについては明らかにはなっていない。本研究によりATF-2がTAK,Smad両経路の共通の核内標的因子であり2つの経路によって別々に生じたTGF- signalを増幅させていることが明らかとなった。私はATF-2がp38の基質であることやTGF-のtarget geneの制御領域内に存在するTGF- response elementにはCRE/TREが多く含まれることからATF-2とTGF- signalとの関係に注目し実験を行ったところ、TGF-によって活性化したTAK1がMKK3/4/6→p38へとリン酸化シグナルを伝達し最終的にp38がATF-2のN端をリン酸化してATF-2の転写活性化能を上昇させること、さらにSmad3/4 complexが核内でATF-2と複合体を形成し、その制御領域にCREを含むTGF- signalのtarget geneの転写を誘導することを見い出した。興味深いことにこのTAK,Smad両経路によるTGF- dependentなATF-2の活性化は同時に協調的に起こることも明らかになった。以上から、ATF-2はTAK,Smad両経路による2つのTGF- signalを1つに統合、増幅するというTGF- signalにおいて重要な役割を担っている転写因子であることが示された。

　1.GST-pull down assayによりATF-2のb-ZIP領域とCBPのC/H2領域がin vitroで結合すること、さらに共免疫沈降実験により両者の結合はin vivoでも確認された。

　2.CAT assayによりCBPがATF-2と結合することによってATF-2の転写活性化能を上昇させることが示された。

　3.in vitroでの競合実験によりCBPはATF-2のb-ZIP領域に結合することによってATF-2の転写活性化を負に制御している、ATF-2の分子内結合を解除していることが示された。

TGF-シグナル伝達系におけるATF-2の機能

　1.GST-pull down assayによりATF-2のb-ZIP領域とTGF-シグナルの伝達経路の1つのグループを構成しているSmad3/4のMH1領域がin vitroで結合すること、さらに共免疫沈降実験によりligand dependentなSmad3/4-ATF-2の結合がin vivoでも確認された。

　2.ATF-2はTGF-シグナルを受けてリン酸化されること。さらにこのリン酸化はTGF-シグナルのもう1つの伝達経路に属する分子であるTAK1を介していることが示された。

　3.CRE配列を持つreportor gene assayによりATF-2の転写活性化能はSmadとの結合、あるいはTAK1を介したリン酸化によってそれぞれ上昇することが観察された。さらにSmad/TAK1の影響を同時に受けるとATF-2の転写活性化は相乗的に増加することが示された。同様の結果はTGF-によって誘導を受ける3TP-lux reporterでも得られた。

　4.3TP-lux reporter gene assayによりATF-2のdominant-negative formはTGF-によるreporter geneの上昇を抑制すること。さらにSmad/TAKによるreporter geneの上昇も抑制することが示された。

　以上、本論文は(1)ATF-2がCBPと結合することにより、分子内結合が解除されて不活性型から活性型状態へと変換すること。(2)ATF-2はTGF-シグナル伝達系においてSmad/TAK1両経路の共通の核内標的因子であることを明らかにした。本研究はこれまで未知に等しかった、ATF-2の分子内結合の解除の機構やTGF-シグナルの核内標的因子の解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値すると考えられる。