B6C3F1マウスの卵巣、精巣、胸腺、顆粒膜細胞、卵母細胞及び過排卵から、Guanidine isothiocyanate法でtotal RNAを採取し、同量のtotal RNAから、Fas/FasLの開始コドンを含むforward primer、終始コドンを含むreverse primer、及びoligomer probeを用いてRT/PCR-Southern blot hybridizationを行った。Fasは卵巣、卵母細胞、過排卵に発現し、FasLは卵巣、顆粒膜細胞に発現していることを同定した。さらに、senseおよびantisense Digを標識したFas/FasL RNA probeを用いてin situ hybridization法でFas/FasL mRNAの局在を調べたところ、Fasは卵母細胞及び発育、成熟した卵胞の顆粒膜細胞に発現し、FasLは顆粒膜細胞に比較的限局して発現していることを確認した。

　PMSGを投与すると、Fas mRNAはPMSG刺激後2日目までは発現していたが、以後は次第に減弱した。これに対応して、FasL mRNAは1日目に最も強く発現し、5日目にはほとんど消失した。また、4、5日目には卵母細胞におけるDNA断片化が認められた。これらの所見はPMSGつまりゴナドトロピンの刺激で、Fas/FasL系の発現が調節され、卵胞閉鎖が進行すると考えた。

　抗Fas/FasL Abを用いてIIF法で調べたところ、in situ bybridization法での観察結果と対応して、Fasは未成熟卵胞の卵母細胞のみに発現し、発育卵胞になってくると卵母細胞と顆粒膜細胞の両方に発現し、FasLは卵胞の顆粒膜細胞に限局してその発現を確認した。さらに、抗Fas Abを用いたWestern blot法により卵巣から45KDa、抗FasL Abでの免疫沈降法により顆粒膜細胞から40KDaの単一バンドを同定した。

　Fas/FasL系の卵胞閉鎖形成における役割を解明するために、FasLを発現している顆粒膜細胞と透明帯除去卵あるいは透明帯付着卵との相互作用反応を観察するin vitroの実験系を作製し、卵のアポトーシスの進行をTUNEL法で測定した。顆粒膜細胞は透明帯除去卵のアポトーシスを誘導したが、透明帯付着卵のアポトーシスは誘導出来なかった。さらに、FasL蛋白が直接Fasを発現している卵のアポトーシスの誘導の可能性を検討するために、FasL cDNAを有する組み換えバキュロウイルスをSf9細胞に感染させ、Sf9-FasL細胞ベクターを樹立した。Sf9-FasL細胞と透明帯除去卵との相互作用反応をin vitroでとり行い、卵のアポトーシスの進行をTUNEL法で観察したところ、Sf9-FasL細胞は卵のアポトーシスを誘導したが、対照としてのSf9-1393細胞では出来なかった。これらin vitroの実験系での所見は、顆粒膜細胞のFasL分子が卵細胞のFasレセプターを介して、アポトーシスを誘導していることを検証したと考える。

　Digを標識したantisense full-length Fas RNA probeを用いて、in situ hybridization法によりMRL/+及びMRL/lprマウス卵巣におけるFas mRNAの発現を調べたところ、MRL/lprマウスの卵母細胞および一部の顆粒膜細胞に、MRL/+マウスの卵巣細胞と同様にFas mRNAの発現を認めた。ところが、抗Fas Abを用いたIIF法で、MRL/+及びMRL/lprマウスの卵胞、卵のFas蛋白質レベルでの発現を調べたところ、MRL/+マウスの卵胞と卵は強く蛍光染色されたが、MRL/lprマウスのそれらは非常に弱く染色された。このIIF法での観察結果と対応して、Western blot法でも、MRL/+マウスの卵巣由来のlysateには濃い45KDaのbandが認められたが、MRL/lprマウスの卵巣由来のそれには薄いbandしか認められなかった。つまり、MRL/lprマウスではFas蛋白の生成不全が起きていることが示唆された。

　Sf9-FasL細胞とMRL/+及びMRL/lprマウス由来の透明帯除去卵との相互作用反応をin vitroで行い、卵のアポトーシスの進行をTUNEL法で観察したところ、Sf9-FasL細胞はMRL/+マウスの卵のアポトーシスを誘導したが、MRL/lprマウスの卵のアポトーシスは誘導出来なかった。

　さらに、in vivoでMRL/+及びMRL/lprマウスの腹腔内に抗Fas Abを注射し、これらのマウスの卵巣および肝臓のアポトーシスをTUNEL、DNA fragmentation法により検討したところ、MRL/+マウスの大部分の卵母細胞、一部の顆粒膜細胞及び大部分の肝細胞にアポトーシス陽性の所見が認められたが、MRL/lprマウスの卵巣、肝臓ではほとんど陰性に近い所見であった。

　20週齢のMRL/lprマウスの卵巣の重量、サイズ及び卵胞数はMRL/+マウスのそれらに比べて顕著に増加し、卵巣腫脹(肥大)が起ることを見い出した。これはアポトーシスからまぬがけれたリンパ球の浸潤によるものではなくて、MRL/lprマウス卵巣構成細胞自身におけるFas death domain欠如によるcaspase cascadeの作動不全のため卵胞閉鎖が惹起されず、卵胞数の著増を来したためであると考えた。

　III.本論文では、マウスの卵巣におけるFasの発現は卵母細胞、過排卵及び一部顆粒膜細胞に、FasLは顆粒膜細胞に発現し、顆粒膜細胞上のFasLは卵母細胞や顆粒膜細胞上のFasレセプターを介し、オートクリン、パラクリン的に作用して、アポトーシスを誘導し、卵胞閉鎖を推進している分子機構を解明した。