TLを高頻度に誘発させるために、Kaplan等により確立された手法を用い、生後33日令のC57BL/6Jマウスに、8日おきに4回の分割照射を行った。線源は¹³⁷Cs線を用い、1回当たりの線量は、1.0Gy、1.5Gy、2.0Gyとした。

　TLやその他の腫瘍の発育の時間的経過を正確に観察するために、病理解剖は初回照射日より50日、75日、100日、125日、150日、175日、200日、250日、300日と経時的に行った。各観察時に、マウスを屠殺し、マウス体重、臓器重量(胸腺、脾臓)、各臓器の肉眼的な異常、腸間膜やリンパ節の異常、胸水や腹水の有無、などを観察した。

　病理解剖後、各マウスから胸腺、肺、肝臓、脾臓の各臓器を摘出し、ブアン固定後、通常の方法でパラフィン包埋を行った。パラフィン包埋した組織から、5mの組織切片をつくり、HE染色を行い、HSR液で封入後、観察用組織標本とした。組織標本は、30倍〜1500倍の光学顕微鏡下で観察し、胸腺組織内での腫瘍細胞の増殖の程度、TLの肺、肝臓、脾臓での浸潤の程度、リンパ節の腫大の程度、などTLの広がりの程度を臓器毎で5段階、リンパ節で4段階に判定し(Class)、それらの結果と臓器肥大の程度などを元にTLの総合重篤度(Severity Index)を判定した。Severity Indexは今回新しく重篤度を判断する方法として導入した指標で、TLの重篤度を、TLの原発臓器である胸腺の状態のみでなく、肝臓、肺、脾臓への転移の程度やリンパ節への腫大の程度を考慮し、TLを総合的に評価しようとしたものである。

　腫瘍の有無の判断の難しい早期のTLを定量的に評価することを目的として、観察日の早い75日群、100日群のマウスに対し、ヒトでは臨床的に使われているp53免疫組織染色を行った。p53免疫組織染色をマウスに適用した事例はほとんどないためヒトに用いられている手法を改善した。組織切片は、脱パラフィンした後、p53のepitopeの回復のためマイクロウェーブ処理をし、p53の抗体M-19を用いて免疫組織染色を行い、カウンター染色を行った。マイクロウェーブの処理時間を約80分にしたこと、および一次抗体の反応時間を2晩にしたのが、主とした改善点である。p53陽性の染色程度(Labeling Index)の評価は、p53陽性細胞の染色数(%)と染色強度(4段階)を用いて判定した。測定は600倍の光学顕微鏡下で行い、測定箇所は各臓器ごとに4箇所とし、臓器毎に平均したものの和をその個体の総合染色程度(Total Labeling Index)とした。

　p53陽性反応個体の割合をFig.3に示す。どの線量群においても100日群において陽性反応個体の割合の増加が認められた。また、75日群から100日群の増加割合は、1.0Gy群、1.5Gy群、2.0Gy群でそれぞれ、14.2%、23.8%、50%であり、線量の高い群ほど急激な増加が認められた。p53陽性反応個体の割合に線量依存性が認められた。また、陽性反応個体の割合には雌雄差は認められなかった。p53のTotal Labeling Index(TLI値)をFig.4に示す。74〜184.7という高いTLI値が線量の高い1.5Gy群、2.0Gy群で認められ、TLI値の線量依存性が認められた。

　(1)発生率 放射線誘発TLの発生率、およびその線量依存性については、先行研究においてもすでに報告されているが、多くの先行研究が死亡時点でTLの発生を確認しているのに対して、本実験では経時的にマウスを解剖した上で病理組織学的にTLの発生を確認しているので、照射後、早い時期での発生率が他の先行研究よりも高い。また今回、TLの発生率には雌雄間で違いがあるだけでなく、線量反応の仕方にも雌雄差が認められ、更には、発症した腫瘍の重篤度に関しては、雌雄間で差がないことがわかった。

　(2)潜伏期 先行研究の最小潜伏期間の長さは、縦隔や末梢のリンパ節の肥大が死の2、3日前に検出されるという理由で、死亡時をリンパ腫発症の時期としたために線量に関わらず最初の照射日より数えて約100日〜120日である。本研究では、最小潜伏期が線量に関わらず50日から75日の間であることが認められた。各臓器の標本の観察により、リンパ節肥大が起こる前に、脾臓、肺などへのTL細胞の転移が認められており、先行研究のように死亡時をTL発症時とすると正確な潜伏期が観察されないものと思われる。また、放射線誘発TLの発生過程で、前がん細胞である前リンパ腫細胞は照射後4日〜8日に胸腺内に生じ、照射後21〜31日目には63%以上の個体の胸腺に検出されるという報告があり、病理学的観察により最小潜伏期の長さが50日から75日であるということは妥当な結果であると考えることができる。

　(3)重篤度 本研究では、TLの発症してくる時期的な違いが線量間で認められないにも関わらず、どの観察日に発症したTLも、線量の高い群の重篤度がより高いことが認められた。これは、従来の放射線防護上の仮定である、確率的影響の重篤度には線量依存性が認められない、に相反する結果である。ガン化までに要する最少の時間は線量に関係なく一定で、ガン化してからの進行のスピード、すなわち重篤度に線量間で差があるということは、今回用いた線量の範囲内においては、放射線のガン化に至るまでの過程に対する影響は同じで、ガンの進行に関する影響が異なるということになる。これについては、ガン化やガンの進行に関係する細胞の変化を量的・質的に更に検討する必要がある。

　マウスTLのp53免疫組織染色の手法は確立されていない。本研究で、抗体濃度、マイクロウェーブ処理時間、一次抗体反応時間、などのさまざまな改善を加え、ブアン固定、パラフィン包埋処理した組織でも定量的に観察が可能な染色標本を作成する手法を考案した。このp53免疫組織染色を用いて、HE染色標本でTLの発症の有無の判断が難しい際に、定量的に腫瘍の有無を判断することを試みたが、SI値が0.4以上のTLにならないと、TLI値が大きく増加しないことがわかった。しかし、高い線量群では、より大きいTLI値が認められ、線量の増加とともにp53の量も増加することがわかった。

　従来、発ガンに関する動物実験の大部分は生涯飼育で行われてきた。しかし、本研究では、経日的に屠殺し観察することによって、TLの発症時期、腫瘍の転移など進行の実態、腫瘍の重篤度の経日変化など貴重な情報を得ることができた。生涯飼育で観察されるマウスは、終末期の状態であるため、ガンの進行の変化に関する情報を得ることは難しい。また、線量の低い実験群では発症してくるガンの数が少ない上に、今回の実験でも観察されたようにガンがゆっくり進行するので、発症してから死に至るまでの時間も長くかかり、生涯飼育では長期的な観察日時が必要となる。以上のことから考えて、TLのように照射後比較的早い時期より発生してくる腫瘍については、飼育期間を決めた経時的観察が望ましいと考える。