培養上清中のCEA濃度から、細胞より分泌されたCEA量を評価した。また細胞抽出液中の全蛋白量に占めるCEA蛋白の量から、細胞内のCEA量を評価した。HeLaでは分泌されたCEA量、細胞内CEA量とも測定下限値以下であった。Su.86.86ではCEA蛋白の存在が細胞内に認められたが、培養上清中のCEAは測定下限値以下の濃度であった。B×PC-3、MKN45は細胞内CEA量がSu.86.86よりも多く、培養上清中のCEA量も各細胞内のCEA量に伴い増加する傾向を示した。以上より、膵癌細胞株Su.86.86、B×PC-3、胃癌細胞株MKN45はCEA産生細胞株、HeLaはCEA非産生細胞株と考えられた。

　3種類のアデノウイルス、AdCEAtk、AdCEAlacZおよびAdPGKtkをCOS-TPC法を用いて作成した。AdCEAtk、AdCEAlacZはCEAプロモーターの下流にHSVtk遺伝子、lacZ遺伝子をそれぞれおいて組み込んだアデノウイルスである。AdPGKtkはホスホグリセロキナーゼ(PGK)プロモーターの下流にHSVtk遺伝子をおいて組み込んだウイルスである。CEAプロモーターにはCEA遺伝子の5’側上流の-424から-2までの断片を用いた。

　各細胞株を96ウエル培養プレートに細胞6×10³個/ウエルで蒔き込み、翌日AdCEAtkまたはAdPGKtkをmoi(multiplicity of infection)30で感染させた。その翌日GCVを0から100Mの濃度で含む培養液を加えた(HeLaのみ1000Mまで検討した)。そして6日後に生存細胞数をMTTアッセイで評価した。結果を図1に示す。AdPGKtkを感染させた場合には、GCVの50%増殖抑制濃度(IC₅₀)はいずれの細胞株においても2M以下となった。一方AdCEAtkを感染させた場合、Su.86.86、B×PC-3、MKN45(■)では、それぞれGCVのIC₅₀は14.7、0.88、1.62Mであった。ところが、HeLa(□)ではGCV濃度1000Mでもコントロールと比較して50%にならなかったので、IC₅₀は1000M以上と考えられた。以上の結果から、AdPGKtkはすべての細胞株でGCV感受性を増強させるが、AdCEAtkはCEA産生細胞でのみGCV感受性を増強させると考えられた。

図1 AdCEAtkおよびAdPGKtk感染後のGCVの50%増殖抑制濃度6×10³個のSu.86.86、B×PC-3、MKN45(■)およびHeLa(□)の各細胞株にAdCEAtkあるいはAoPGKtkをmoi30で感染させ、その翌日GCVを0から100Mの濃度で(HeLaのみ0から1000Mまで)培養液に添加した。そして6日後に生存細胞数をMTTアッセイで評価した。各細胞株について3回ずつ実験を行い、得られたIC₅₀の平均と標準偏差を示した。

　AdCEAtk感染により遺伝子導入を行った細胞を遺伝子導入を行っていない細胞と0から100%の間で割合を変えて混合し、GCV濃度40Mにおける生存細胞数の評価を3)と同様に行った。遺伝子導入細胞を5%および20%混合すると生存細胞数はそれぞれ40%および70%程度減少した。GCVによる殺細胞効果が遺伝子導入細胞のみに及ぶと考えると、生存細胞数は5%および20%程度の減少となることが予想されるため、遺伝子が導入されていない細胞にも殺細胞効果が生じたことが示唆された。

　in vivoにおいてAdCEAtk感染により有効な遺伝子導入が行われ、かつ導入遺伝子が発現していることを確認するため、マウス皮下腫瘍モデルを用いた。AdCEAtkまたはAdCEAlacZを腫瘍に注入し、腫瘍細胞におけるCEA蛋白の産生とHSVtk蛋白の発現を免疫染色にて検討した。1×10⁶個のSu.86.86細胞をマウスの側腹部皮下に注入して皮下腫瘍を作成し、翌日AdCEAtkまたはAdCEAlacZ(2.6×10⁸pfu)を注入した。ウイルス注入10日後に皮下腫瘍を切り出して固定後に切片とし、連続した切片に対してそれぞれCEAおよびHSVtk蛋白の免疫染色を行った。いずれのウイルスを注入した腫瘍も抗CEA抗体による染色では腫瘍細胞の細胞質に染色が認められたため、細胞内にCEA蛋白が存在すると考えられた。抗HSVtk抗体を用いて染色を行った場合には、AdCEAtkを注入した腫瘍ではCEA陽性細胞にほぼ一致して細胞質に染色が陽性であったが、AdCEAlacZを注入した腫瘍では染色が認められなかった。これらの結果から、HSVtk蛋白の発現はAdCEAtkが感染したCEA産生腫瘍細胞でのみ認められたと考えられた。

　in vivoにおけるAdCEAtk注入とGCV投与によるCEA産生膵癌治療の有効性を検討するため、5)と同じマウス皮下腫瘍モデルを用いて治療効果の評価を行った。結果を図2に示す。AdCEAtkで処理を行った治療群とAdPGKtkで処理を行ったポジティブコントロール群では著明な腫瘍増大抑制効果が認められた。ポジティブコントロール群を除いた5群の平均と治療群の平均を比較したところ、治療群は10日後では84.6%、19日後では94.1%の腫瘍体積の減少が認められ、これは統計学的に有意であった。以上より、AdCEAtkとGCVを用いた治療群では、対照群と比較して著明な腫瘍の増殖抑制効果を認めたと考えられた。

図2 AdCEAtk感染とGCV投与による腫瘍増大抑制効果1×10⁶個のCEA産生Su.86.86細胞により作成したマウス皮下腫瘍モデルを用いて、AdCEAtk注入後GCV投与を行う群(●)、行わない群(○)、ウイルスを含まない培養液を注入後GCV投与を行う群(■)、行わない群(□)、AdCEAlacZ注入後GCV投与を行う群(▲)、AdPGKtk注入後GCV投与を行う群(◆)、行わない群(◇)の7群を検討した。いずれのウイルスも2.6×10⁸pfuを腫瘍作成の翌日、腫瘍内注入した。さらにその翌日から、体重あたり200mg/kgのGCVを4回に分けて隔日で腹腔内投与した。腫瘍体積(mm³)は、(長径(mm)×短径(mm)²)/2にて算出し、平均と標準偏差を示した。