血管内皮細胞増殖因子(VEGF)は内皮細胞に限局して発現する受容体型チロシンキナーゼ、Flt-1,KDR/Flk-1レセプターを介して内皮細胞の増殖、血管新生、血管透過性こう進に関与すると考えられている。近年、哺乳類のVEGFに相同性のあるポリペプチドをコードする遺伝子がパラポックスウィルス属のオーフウィルスのゲノム内に見い出された。

　羊、山羊、時には人などに感染するオーフウィルスの感染病巣では皮膚の毛細血管内皮細胞の増殖が見られ、その病巣の進展にはこのVEGF類似蛋白質の関与も考えられる。

　今回、我々はオーフウィルス由来のVEGF類似蛋白質を精製し(VEGF-Eと呼ぶ)VEGFファミリーの新しい蛋白質として、結合レセプターの特異性とその生物学的活性について検討を行った。

　最近、VEGFに関連のある遺伝子が次々と同定され、機能解析が行われている。これまで、VEGFファミリーには、胎盤の維持に関与するとされるPIGF,リンパ管の発達や形成に関与するとされるVEGF-CとVEGF-D、まだ機能の詳細は不明と思われるVEGF-Bが知られている。VEGF-Eと上記のVEGFファミリーのリガンドとを比較してみると、これらのリガンドでは8つのシステインがすべて保存されており、そのシステインにより、ループ1,ループ2,ループ3に分けられた共通した構造をとっている。VEGF-EはVEGF₁₆₅やVEGF₁₈₉に見られるような塩基性領域を欠いたVEGF₁₂₁に最も近い構造で、アミノ酸レベルで約25%の相同性を示した。

　VEGF-Eをバキュロウイルス系にて大量発現させたところ、VEGF-Eは分泌型蛋白質でウサギのVEGF-Eに対する抗体で特異的に検出された。VEGF-Eは44kDaの蛋白質で、還元剤を用いた検討から22kDaの2つのサブユニットがホモダイマーを形成していることが明らかとなった。

　次にVEGF-Eが大量に発現した培養液の上清を用い、VEGF-EをSPカラムにて精製した。VEGF-Eが描出された事をVEGF-Eに対する特異抗体を用いてウエスタンブロッティングで確認し、同時にVEGF-Eがバルクの蛋白と分離できた事を銀染色にて確認した。

　次にこうして精製されたVEGF-Eの生物学的活性として、まず内皮細胞増殖活性を調べた。人臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)とラット肝類洞壁内皮細胞(NP cell)を増殖因子のない状態、VEGF存在下、VEGF-E存在下に各々4日間培養した。VEGF-EはVEGF₁₂₁と構造上最も相同性が高いが、どちらの内皮細胞でも、VEGF-Eは濃度依存的に増殖活性と形態変化が見られその活性はVEGF₁₆₅とほぼ同等レベルだった。

　次に血管透過性こう進活性を調べるため、モルモットを用いてMiles assayを行った。VEGF-Eは濃度依存的かつVEGF₁₆₅とほぼ同等レベルで血管透過性を刺激した。

　次にVEGF-Eが結合するレセプターを調べるため、¹²⁵I-VEGF₁₆₅をKDR/Flk-1,Flt-1を各々強発現させたNIH3T3細胞と一緒にインキュベートし、そこに非放射性VEGF₁₆₅あるいはVEGF-Eを添加し、特異的結合に対する競合を調べた。非放射性VEGF-Eは¹²⁵I-VEGF₁₆₅のKDR/Flk-1への結合を競合的に阻害したが、その程度は非放射性VEGF₁₆₅とほぼ同じ程度だった。

　一方、非放射性VEGF₁₆₅は¹²⁵I-VEGF₁₆₅のFlt-1への結合を競合したが、非放射性VEGF-Eは1000倍添加しても競合しなかった。

　さらに、VEGF-Eを放射性ヨードラベルし同様に競合実験を行った。これらの結果からもVEGF-EはVEGF₁₆₅と同じ親和性(Kd330pM)でKDR/Flk-1には結合できるが、Flt-1には結合しないことが強く示唆された。

　VEGF-EがKDR/Flk-1レセプターのみに結合し活性化する事をさらに裏づけるものとして、レセプターの自己リン酸化を調べた。KDR/Flk-1又はFlt-1を強発現したNIH3T3細胞をリガンドで5分間刺激した細胞可溶化液をKDR/Flk-1抗体またはFlt-1抗体で免疫沈降した。各々の免疫沈降物を抗リン酸化チロシン抗体と抗KDR/Flk-1抗体、抗リン酸化チロシン抗体と抗Flt-1抗体でウエスタンブロットした。KDR強発現3T3細胞ではVEGF,VEGF-Eで刺激するとKDRレセプターの自己リン酸化が230kDaに見られた。Flt-1強発現3T3細胞ではVEGF刺激でFlt-1レセプターの自己リン酸化が180kDaに認められたが、VEGF-Eでは認められなかった。

　これらの結果から、VEGF-Eは内皮細胞特異的に発現するVEGFレセプターのうちKDRに特異的に結合し活性化することが明らかになった。

　さらに、NP細胞をVEGF-Eにて刺激し時間経過を追って見ると、VEGF-EはVEGFと同様、KDR/Flk-1からPLC、MAPキナーゼを介する細胞内シグナル伝達系を刺激する事が示された。

　VEGF-Eはアミノ酸レベルでPDGFと15%の相同性を示すので、VEGF-EがPDGFレセプターやFGFレセプターのリン酸化を刺激するかどうか検討を行った。NIH3T3細胞に各々PDGF,bFGF,VEGF-Eを加え4日間培養した。PDGF-B/BとbFGFはNIH3T3細胞に発現しているPDGF,FGFレセプターの自己リン酸化を刺激し細胞増殖や形態変化を示すが、VEGF-Eは増殖因子のないのと同じくこれらの活性が認められなかった。

　なお、Flt-4レセプターを強発現させたNIH3T3細胞を用いて、VEGF-EがFlt-4レセプターのリン酸化を刺激しない事も確認した。

　近年、VEGF₁₆₅がエクソン7のヘパリン結合ドメインにより130kDa細胞表面分子(neuropilin 1)へ結合することで,VEGF₁₆₅のKDRへの結合力を高め、VEGF₁₆₅の化学走性活性を強める事が報告された。そこで、VEGF-Eが130kDa細胞表面分子(neuropilin 1)に結合するかどうかの検討を行うため,¹²⁵I-VEGF₁₆₅をHUVECの細胞表面分子とDSSにてcrosslinkingさせた会合物に対し,非放射性VEGF₁₆₅またはVEGF-Eを加え競合実験を行った。非放射性VEGF-Eは¹²⁵I-VEGF₁₆₅とKDR/Flk-1の会合物に対し競合するが、¹²⁵I-VEGF₁₆₅と130kDa細胞表面分子(neuropilin 1)との会合物には競合しなかった。これらの結果からVEGF-Eが130kDa細胞表面分子(neuropilin 1)へ結合しなくても、VEGF₁₆₅同様KDR/Flk-1に特異的に結合し生物学的活性を持つことがわかった。

　最後に種々のリガンドをマトリゲルに添加した後、マウスの側腹部の皮下に注入し4日後にゲルをとりだし個体レベルでの血管新生を調べた。肉眼的に、VEGF₁₆₅またはVEGF-Eを含むマトリゲルでは、PBSだけ含むマトリゲルの対照群に比べ血管が豊富であった。実体顕微鏡でVEGF-Eを含むマトリゲルを観察すると、既存の拡張した血管から多くの新生毛細血管がマトリゲルへ侵入していた。ゲルの切片でも、PBSだけ含むマトリゲルの対照群では血管は見られなかったが、VEGF₁₆₅またはVEGF-Eを含むマトリゲルでは拡張した血管、新生毛細血管などが認められた。従って、VEGF-EはVEGFに匹敵する血管新生の活性をもつことが個体レベルでも確認できた。

　本研究では、新しいVEGFファミリー蛋白質と考えられるオーフウィルス由来VEGF(VEGF-E)について、その結合レセプターと生物学的活性を検討した。

　今回の研究で得られた知見としては、

　1 VEGF-EはVEGFとアミノ酸で19-25%しか相同性がないが,VEGF₁₆₅と同じ位高い親和性でKDR/Flk-1に結合する。

　2 これまで知られているVEGFファミリーの他のタイプと異なり、VEGF-EはFlt-1への結合も、Flt-1からのシグナル伝達も行わない。

　3 VEGF-Eはヘパリン結合ドメインを持っていないが、内皮細胞の増殖刺激活性と血管透過性活性は強力な血管新生/血管透過性因子であるVEGF₁₆₅とほぼ同じ程度であった。これらの点で、今までのVEGFファミリーにない新しい蛋白質であり興味深い。

　今まで報告されているVEGFとKDR/Flk-1との結合部位はVEGF-Eにはあてはまらず、他に異なる結合部位が示唆され、今後mutagenesisによる解析を行っていく予定である。

　また最近、パラポックスウィルスのゲノム内にIL-10遺伝子が同定され脊椎動物のゲノムに相同性が高くウィルスが脊椎動物のゲノムから獲得したと考えられる。VEGF-Eも脊椎動物のゲノムに由来している可能性がありin vivoで胎生期または大人になってある時期、ある特異的組織で発現している可能性もある。ノックアウトマウスを用いた解析ではKDR/Flk-1は、胎生期初期の血管構築と血球形成に重要だと報告されており、VEGF-EがVEGFと協調してこれらのプロセスの一部を調節する因子である可能性が考えられる。