全身性エリテマトーデス(Systemic Lupus Erythematosus;SLE)は紅斑,多関節炎,漿膜炎,腎障害,中枢神経症状など多彩な臨床症状を呈する多臓器障害性の慢性炎症性疾患である.また末梢血液中においては多種の自己抗体の出現の他,高免疫複合体血症,低補体血症,リンパ球減少など多くの免疫学的異常が認められる.このためSLEは全身性自己免疫疾患の一つと考えられている.全身性自己免疫疾患では自己抗体それ自体が病変を形成する役割を持つかどうかは不明であるが,疾患特異的な自己抗体が存在することからそれが産生される機序と疾患の発症機序は密接に結びついている可能性が強い.自己抗体産生機序については,抗体のIgGへのクラススイッチや,高親和性変異抗体のクローン性増殖が見られることからT細胞依存性と考えられる.また著者の所属する研究室ではこれまで自己抗体の標的となる自己抗原のB細胞エピトープの解析,及び自己抗原反応性T細胞の解析から自己抗原特異的T細胞が活性化されていることを見出しており,自己抗体産生に抗原特異的T細胞が関与していることが示唆される.したがって自己免疫疾患の発症機序においても抗原特異的T細胞が重要な役割を果たしている可能性が強く考えられる.

　SLEで抗原非特異的T細胞については数多くの検索が行なわれており, CD4/CD8T細胞比の上昇,著しいnaive/memory T細胞比の低下,抑制性T細胞機能の低下などが報告されている.しかし抗原特異的T細胞についてはほとんど報告がなく,それが病態形成にどのように関与しているかは未だ明かではない.そこで本研究ではSLEの病態形成における抗原特異的T細胞の役割を解明するため,患者末梢血中T細胞のT細胞レセプター鎖から見たクロノタイプについて検討した.すなわちT細胞は特異抗原の刺激によりクローナルに増殖することから,抗原特異的T細胞を解析するためにT細胞のクローナルな増殖の有無を調べることは非常に有用と考えられる.現在のところ未知の標的抗原に対するT細胞のクローナルな増殖を検出する唯一の方法は個々のT細胞ごとに異なるT細胞レセプター(T cell receptor;TCR)遺伝子の解析である.本研究では著者の所属する研究室で確立したRT-PCR-SSCP法を用いたT細胞クローナリティー検出システムにより,疾患活動性の異なるSLE患者末梢血T細胞を解析した.

　急性増悪期のSLE患者6例,及び軽症例の患者7例を対象とした.重症例では6例中5例が腎障害を伴い,そのうち4例で腎生検によりループス腎炎が確認された.疾患活動性についてはSLE disease activity index(SLEDAI)を用いて評価した.今回検討した患者では急性増悪例はスコア15以上,軽症例は10以下であった.急性増悪例では全例検体採取に前後してステロイド大量投与を施行した.軽症例ではステロイドの維持量を投与中であった.急性増悪患者3例と軽症患者1例について6カ月後に再度検体を採取した.

　対象患者末梢血より不連続密度勾配遠心法で単核球を分離し,一部は抗CD4あるいは抗CD8抗体の結合した磁気ビーズを用いて陽性分画を回収した.急性増悪期患者2例ではさらにT細胞の活性化マーカーであるCD45RO,HLA-DRについて同様に陽性分画を回収した.また別の急性増悪期患者1例では早期活性化マーカーである抗CD69抗体を二次抗体を介して磁気ビーズに結合させ,それを用いて陰性分画を回収した.それらの単核球からRNAを抽出し,得られたRNAを鋳型にランダム配列6塩基プライマーと逆転写酵素によりcDNAを合成した.これを鋳型にして各TCRBVファミリー遺伝子配列に特異的なプライマー(BV sense primer BV1-20計22ファミリー)と,共通のTCRBC特異的プライマー(non-biotinylated BC antisense primer;sequences)でPCR法にてTCR鎖のCDR3を含む領域の遺伝子を各ファミリー毎に増幅した.これをSSCP法で解析するわけであるが,この方法は抗原特異的なTCRV遺伝子の塩基配列の違いにより生まれるゲル移動度の差を見ることにより,そのT細胞集団の中で高頻度に発現されているTCR鎖を検出する実験系である.SSCP法では熱変性させた一本鎖TCRBV遺伝子は塩基配列依存性の高次構造を形成し,その高次構造依存性に展開される.したがってこのシステムでは著しい多様性のあるT細胞集団ではスメア状の幅広いバンドとなるが,単一のTCRを発現するT細胞クローンでは一本のバンドのみが検出される.健常人では少数のバンドが見られるもののほとんどすべてのBVファミリーにおいてスメアパターンを示した.一方SLE患者ではT細胞クローンの集積を示すバンドが多数認められ,疾患活動性が高くなるとこの傾向はより顕著であった.またBVファミリーについては1から20まで特にバンド数の偏りは認めなかった.軽症例では平均67±21,急性増悪例では平均122±14で有意な差が認められた.

　次にクローナルに集積したT細胞のフェノタイプについて検討した.健常人ではほとんどスメア状であり,クローナルな集積を示すバンドはごく少数しか見られないが,すべてCD8陽性であった.軽症患者ではバンドは多数見られるがその大部分がCD8陽性T細胞であり,CD4陽性T細胞のバンドはCD8陽性と比較して少数である.一方急性増悪患者ではバンド数は全体的にさらに多くなり,CD8陽性サブセットのバンド数も増加するが,CD4陽性T細胞でも明らかなバンドが多数認められるようになった.SLEでは活動性が高くなると末梢ではCD4陽性T細胞数は全体数としては減少することが知られているが,クローンとしてみると逆に増加し,高度に集積しているということが判明した.CD4陽性サブセットとCD8陽性サブセットのバンド数の比は軽症例で平均0.33±0.15(CD4/CD8),急性増悪例で平均0.99±0.12であった.さらに急性増悪期患者2例ではクローナルに集積したCD4陽性T細胞は大部分がCD45RO,HLA-DRともに陽性であった.また急性増悪期患者1例ではクローナルに集積しているCD4陽性T細胞は活性化マーカーCD45ROは大部分が陽性だが,CD69は大部分陰性であった.より早期に発現される活性化マーカーであるCD69に関しては採血を行った急性増悪の症状が完成された時点ではすでに発現を終え陰性化していると考えられた.急性増悪期患者3例,軽症患者1例について治療前,治療後の経時的変化について観察した.急性増悪期患者ではステロイド大量投与で疾患活動性が低下するとバンド数は各例とも減少した.バンド数は治療前の平均122±14本から治療後48±10本と有意に減少した.急性増悪期から寛解期に入り,ステロイドも減量が進んで維持量となるとT細胞のオリゴクローナルな増殖は減少することが判明した.さらにCD4,CD8陽性の各サブセットについてみるとバンド数の比は治療前の平均0.99±0.12から0.53±0.11(CD4/CD8)と有意に低下していた.急性増悪で増加したCD4陽性サブセットのクローナルな集積が疾患活動性の低下に伴って減少し,CD4/CD8バンド数の比は軽症例パターンへと近づいた.また軽症患者の場合も治療を続けてさらに軽快してステロイド剤を離脱できる状態になるとT細胞のオリゴクローナルな増殖も一層減少し,健常人パターンへ近づくことも判明した.

　さらに急性増悪期患者2例についてジデオキシ塩基配列決定法により,TCR V-D(N)-J塩基配列を解析した.2例ともBV5S2ファミリーについて増幅したcDNAを用いた.治療前,後約30の塩基配列を解析し,その頻度からT細胞クローンを決定した.複数個現れたクローンはSSCP法で検出されたバンドに対応していると考えられる.するとたいへん興味深いことにいずれの患者においても,治療前に存在したクローンの一部は治療後にも残存するが,治療後に消失してしまうクローンと治療後に新たに出現するクローンのあることが判明した.SSCP法により得られた結果と合わせて考えると治療前後の経過を通して残存するクローンはCD8陽性T細胞,急性期のみにみられ治療後に消失するクローンはCD4陽性T細胞,治療後に新たに出現するクローンはCD8陽性T細胞と考えられた.

　以上の結果から特に疾患活動性に伴ってクローナルに増殖するCD4陽性T細胞がSLEの病因,病態の形成に深く関与している可能性が考えられた.

　SLE患者末梢血中に見られるT細胞クローンが疾患活動性の変化に伴ってどのような挙動を示すかを検討することが,病態形成に果たす役割を知る上で重要と考えられる.実際には寛解期にある症例がいつ急性増悪を来すか予測は難しいが,寛解期でも抗原特異的T細胞クローンの挙動を追い続けることによりその予測が可能になれば,致命的な急性増悪を未然に防ぐことができるかもしれない.さらには病態形成に関わる特異抗原を特定することにより,将来的には抗原特異的免疫療法の可能性にもつながると考えられる.