細胞接着分子のintegrinは細胞膜貫通型の鎖鎖よりなるheterodimerの受容体である。integrinはinside-outのシグナル伝達によりコンフォーメーションが変化し、活性化され、細胞の接着や分化を制御する。特に、血小板表面上のintegrin₂₁はコラーゲンと接着しintegrin_IIb3を活性化する。また、活性化したintegrin_IIb3はfibrinogenと接着し血小板同士の凝集に関わっている。

　さて、H-Rasとintegrin_IIb3をCHO細胞(Chinese Hamster Ovary Cell)にトランスフェクションし、integrin_IIb3の活性化を調べた報告から、H-Rasがintegrin_IIb3の活性化を抑制していることが明らかとなった。この抑制メカニズムには、転写は関係しておらず、無核細胞である血小板でも存在する系と考えられた。しかし、生体の血小板でのH-Rasの役割については試験管内での実験結果からだけでは明らかでない。そこで、私は、H-Ras過剰発現マウスとH-Ras欠損マウスの血小板を用いて、ADPおよびコラーゲンをagonistとして加え、比濁法により血小板凝集能を測定した。その結果、ADPによる1次凝集はH-Ras欠損マウスとH-Ras過剰発現マウスおよび野生型マウスで著明な差を認めなかった。コラーゲンによる2次凝集はH-Ras過剰発現マウスでは著明に抑制され、H-Ras欠損マウスでは若干亢進していた。また、ADPによる凝集曲線の形より2次凝集に相当すると思われる部分はH-Ras過剰発現マウスで抑制、H-Ras欠損マウスで亢進している傾向が見られた。

　以上より、H-Rasは血小板2次凝集を抑制し、その結果、血小板凝集能も抑制することが示された。

　さて、H-Rasが血小板の2次凝集を抑制するメカニズムは明らかではないが、H-Rasが血小板膜上のintegrinの発現を制御していて、受容体数が減少しているため、血小板凝集能が抑制されている可能性も否定できない。この可能性を検討するため、flowcytometry解析により、野生型およびH-Ras過剰発現マウス、H-Ras欠損マウスの血小板上のintegrinの発現を調べた。その結果、integrin₂₁の発現はH-Ras過剰発現マウスでもH-Ras欠損マウスでも有意な変化を認めなかった。ただし、H-Ras欠損マウスで2相性である可能性は否定できない。また、integrin_IIb3はH-Ras欠損マウスでは有意な変化を認めなかったが、H-Ras過剰発現マウスで野生型マウスの約2倍の発現量を認めた。発現量が増加すれば、凝集能は亢進すると考えられるが、血小板凝集能の結果から、凝集は低下しており、従って、H-Rasはシグナル伝達を通じて、血小板凝集能を抑制していると結論した。

　H-Rasがintegrinを抑制する機構はまだ解明されていない。血小板でもH-Rasがintegrinを抑制することは、血小板を抑制するとされるPDGF、NOの下流にH-Rasがあることと一致する。また、PDGFやNOと同様の抑制作用が知られているProstaglandin E₁のシグナルの下流の分子であるか、もしくは、下流の分子を抑制している可能性も考えられる。また、₃-endonexinやCD98の発現を制御することにより、integrin_IIb3を抑制している可能性も考えられる。また、₃の過剰発現によりintegrin_v3を抑制する観察も報告されており、同様の機構が血小板にも存在する可能性もある。血小板凝集の生体内では止血と傷害の修復に大きな役割を果たしている。そこで、生体内でH-Rasが血小板凝集能抑制を通して果たす役割を、bleomycin肺損傷の修復の系を用いて検討した。bleomycin肺傷害後の線維化病変の形成を具体的に述べる。傷害部位で露出した細胞外マトリックスであるコラーゲンにより活性化した血小板は凝集し、PDGF、IGF、TGFなどのchemoattractantsを放出し、macrophageをはじめとする炎症細胞が遊走・集積を始める。そして、さらにautocrine的にchemoattractantsを放出し、さらに細胞遊走と集積とを引き起こすとともに、線維芽細胞がコラーゲンを生産する。こうして、沈着したコラーゲンが肺線維化病変となる。

　このように血小板凝集が傷害の治癒とremodelingの最初に起きる反応であるならば、H-Rasは血小板凝集を抑制するため、傷害のremodelingをも抑制すると考えられた。そこで、H-Ras過剰発現マウスとH-Ras欠損マウスを用いて、bleomycin肺傷害とその線維化病変について検討した。bleomycinを10日間連続投与して、第7日目にmacrophageの集積を、また、第14日目に線維化病変の形成を調べた。その結果、H-Ras欠損マウスと野生型マウスでは、第7日目のmacrophage集積は約2倍に増加しており、第14日目の線維化病変も形成していたが、H-Ras過剰発現マウスでは、第7日目のmacrophageの集積も、第14日目の線維化病変も認めなかった。

　H-Ras欠損マウスとその野生型マウスを比較して、線維化病変に有意な差がなかったのは、体内の生理学的濃度では、血小板凝集能に著明な差が出なかったためと考えられた。また、H-Ras欠損マウスとその野生型マウスがC57BL/6Jと129/SvJとの交雑系統であることも理由と考えられた。

　以上の実験から、H-Rasは血小板凝集を抑制し、さらに、bleomycin肺傷害の線維化病変の形成も抑制することが示された。

　さて、H-Ras過剰発現マウスは血管肉腫を高率に発症し、その際、多量の腹腔内出血を認め、血小板凝集能低下が病態に関与していることが予想された。また、beige mouseはdense granule欠損により、血小板凝集能が低下するが、bleomycin肺傷害による線維化病変が生じやすいことが報告されている。これは、2次凝集が抑制されているH-Ras過剰発現マウスと原理的に1次凝集が抑制されているbeige mouseとの差と考えられた。ヒトの疾患であるGray Platelet Syndromeは-granule欠損により本来-granulc内に貯蔵されているべきPDGFとTGFが放出され、骨髄の線維化等が認められるが、H-Ras過剰発現マウスでは認めない。H-Ras過剰発現マウスでは-granuleの放出も含めた血小板2次凝集能の抑制が起こっていると考えられた。

　これまで、生体の実験系では、癌遺伝子として知られてきたH-Rasが本研究では、血小板凝集能低下を通じて、治癒の方向に働くことが示された。この事実から、特発性肺線維症の病態の解明、治療法の開発に大きく寄与すると予想された。また、血小板凝集・傷害とremodelingの実験でH-Rasの転写を介さない新しい生体機能の存在が示唆された。

　本研究はintegrinの活性化の制御に重要な役割を果たしていると考えられるH-Rasの生体での機能を明らかにするため、H-Ras過剰発現マウスとH-Ras欠損マウスを用いて、integrinが重要な役割を果たす血小板凝集能を測定し、さらに、血小板凝集が重要な役割を果たしているブレオマイシンの肺線維化病変の実験系を用いて、H-Rasの生体における機能の解析を試みたものであり、下記の結果を得ている。

　1.コラーゲンによる血小板凝集を測定すると、H-Ras欠損マウスの血小板凝集能は亢進傾向にあり、H-Ras過剰発現マウスの血小板凝集能は抑制されていた。

　2.flowcytometry解析により、血小板表面のintegrin_IIb3とintegrin₂₁との発現を調べたところ、H-Ras欠損マウスでは、integrin_IIb3とintegrin₂₁ともに野生型マウスと差を認めなかった。一方、H-Ras過剰発現マウスは、integrin₂₁では野生型と差を認めなかったが、integrin_IIb3の発現は野生型に比し著明に増加していた。

　3.H-Ras過剰発現マウスでは、integrin_IIb3の発現が増加しているにも関わらず、血小板凝集能が抑制されており、この結果より、H-Rasを介するシグナルはintegrin_IIb3の活性化を抑制するため、H-Ras過剰発現マウスの血小板凝集能も低下する、と結論した。

　4.血小板凝集が初期に起こる重要な過程と考えられているBleomycin肺傷害の実験系で、H-Rasの役割を検討した。

　気管支肺胞洗浄による、急性期の肺へのmacrophageを主とする炎症細胞の肺への集積を検討したところ、H-Ras過剰発現マウスと野生型マウスでは、bleomycin投与群では、全肺あたりの総細胞数でもmacrophage数でも、コントロールであるsaline投与群に比べて約2倍に増加していたのに対し、H-Ras過剰発現マウスでは、両群で著明な差を認めなかった。

　また、組織学的検索によると、H-Ras欠損マウスおよび野生型マウスでは、肺に線維化病変を認めたほか、気道の破壊・再構築や収縮性病変を認め、これらの病変が胸膜側より生じており、典型的なbleomycin肺傷害と考えられた。一方、H-Ras過剰発現マウスは、上記の様な傷害所見は全く認められなかった。

　以上の実験より、H-Ras過剰発現マウスのbleomycin肺傷害では、炎症細胞の遊走が抑制され、その結果、線維化病変も抑制された。その原因として、H-Rasを介するシグナルによりintegrin_IIb3の活性化が抑制され、その結果、血小板凝集が抑制されたため、炎症細胞の遊走が起こらなかった可能性が考えられた。ただし、H-Rasのシグナルがmacrophageの遊走に抑制的に働いている可能性も否定できなかった。

　以上、本論文は血小板の生体内の機能である、止血・血栓作用と創傷・修復作用をH-Ras過剰発現マウスとH-Ras欠損マウスを用いて、in vitroの血小板凝集能や血小板表面抗原の解析、in vivoにおけるbleomycin肺傷害モデルでの解析により、血小板でのH-Rasシグナルの新たな機能を明らかにした。H-Rasの血小板での機能はこれまで、全く知られていなかった。しかし、本実験により血小板における生理的な機能、そして、血小板が重要な役割を果たす傷害・修復におけるH-Rasの機能が明らかとなったと考えられ、H-Rasを介するシグナルの生体での役割の解明に大きな貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。