PDGFXRをコードするcDNAを組み込んだ、複製能力の欠如したアデノウイルス(AdenoXR)を作成した。コントロールアデノウイルスとして大腸菌-galactosidase(LacZ)をコードするAdenoLacZを用いた。

　ウイスターラット(オス、体重300g)の左総頚動脈にバルーン内皮剥離障害術を施行した。5日後に上記のウイルスを頚動脈内腔に投与した。バルーン障害後8、10、14日後に頚動脈を摘出し、(1)Xgal染色、(2)BrdU染色、(3)内膜中膜面積比(I/M比)、(4)ウエスタンプロットによるPDGF-,受容体、およびEGF受容体のリン酸化、の測定を行った。

　PDGFXR cDNAを含む発現プラスミドpCAGGS-XRをCHO-K1細胞にトランスフェクトし、CHO細胞PDGFXR安定発現株を樹立した。その培養上清を採取後濃縮し、wheat germ agglutinin(WGA)Sepharose6MBにて精製した。一部の実験には昆虫細胞(Sf9)で産生した組換えPDGFXR蛋白を用いた。

　バルーン障害頚動脈の内膜肥厚部分、生後7日令のラット大動脈、生後18週令のラット大動脈よりexplant法にて培養平滑筋細胞(SMC)を樹立した(各々、neointimal SMC,newborn rat SMC、adult rat SMCと略す)。

　総RNAを抽出し,ホルムアルデヒドゲルにより泳動分離後,ナイロン膜に転写し,[-³²P]dCTPで標識したラットPDGF-B鎖cDNAプローブを用い,ハイブリダイゼーションを行った.

　AngII(10^-8M)の添加36時間後に,培養上清を採取し,トリクロロ酢酸を用いて上清中のタンパクを変性回収した.SDS-PAGEにて泳動分離後ナイロン膜に転写し,PDGF-B鎖を認識する特異抗体でウエスタンプロットした.

　細胞溶解物をそれぞれの特異抗体で免疫沈降し,[-³²P]ATP存在下で各々ミエリン塩基性蛋白(ERK)、GST-c-Jun(JNK)、GST-ATF2(p38)のリン酸化を測定した.

　約1.0kbのPDGF-B鎖プロモーター領域(-956〜+45)を,ルシフェラーゼレポーターベクターpGL2basicに組み込み、レポーターベクターSis-Lucを作製した。Sis-Lucを細胞にトランスフェクションし,AngII刺激4時間後に細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した.

　(1)neointimal SMCおよびnewborn rat SMCでは、AngII刺激によりPDGF-B鎖mRNAの発現が誘導された。これとは対照的に、adult rat SMCではPDGF-B鎖mRNAはAngIIによって誘導されなかった。また、AngII刺激によりnewborn rat SMCの培養上清中のPDGF-Bタンパクは増加した。

　(2)newborn rat SMCにおける、AngIIによるPDGF-B鎖mRNAの発現誘導は、AT1R拮抗薬CV11974で完全に抑制されたが、AT2R拮抗薬PD123319では抑制されなかった。

　(3)AngII刺激により3つのMAPキナーゼ(ERK,JNK,p38)のいずれも活性化された。MEK阻害剤であるPD98059は、AngIIによるPDGF-B鎖mRNAの発現をほぼ完全に抑制した。一方p38阻害剤であるSB203580には抑制作用はなかった。

　(4)Sis-Lucをトランスフェクトしたnewborn rat SMCをAngIIで刺激すると、ルシフェラーゼ活性が上昇した。また、Sis-Lucとともに各MAPキナーゼの優性抑制型発現ベクターを遺伝子導入した。AngIIによるルシフェラーゼ活性の増加は優性抑制型ERKおよび優性抑制型JNKの発現により抑制された。優性抑制型p38には抑制作用はなかった。

　(5)アデノウイルスを用いて優性抑制型Ras変異体を発現させると、AngIIによるERKの活性化とPDGF-B鎖mRNAの発現誘導は抑制された。しかしJNKの活性化は抑制されなかった。

　(5)サイクリックGMPおよびサイクリックAMPの誘導体により、AngIIによるERK及びJNKの活性化は抑制され、これとともにPDGF-B鎖mRNAの発現も抑制された。

　障害後5日目にアデノウイルスを投与することで遺伝子導入効率は飛躍的に上昇した。LacZ遺伝子は、ほぼすべての内膜細胞に導入された。一方、中膜平滑筋細胞はごく少数が遺伝子導入された。内膜と中膜に存在する平滑筋細胞間で、アデノウイルスによる遺伝子導入効率に差がある理由は現在のところ不明である。あるクラスのインテグリンはアデノウイルスの細胞への侵入経路として関与している可能性が報告されていることから、内膜細胞と中膜細胞に発現しているインテグリンのクラスの違いが感染効率の差異の原因の一つである可能性がある。

　障害後5日目にPDGFXR発現ウイルスを感染させることにより、その後の内膜肥厚形成が著明に抑制された。従来、血管障害時に血小板より放出されたPDGFが内膜形成の早期の段階(障害後4〜5日以内)で関与しているとされていたが、本実験の結果は、内膜が急速に増大する時期(5〜14日)においてもPDGF-B鎖が中心的な働きをしていることを示している。さらにこの結果は血小板の影響の少なくなった同時期において、PDGF-B鎖が血管壁自体で産生されていることを示唆している。また、PDGFXRが、in vivo血管においてPDGF-B鎖の作用を十分に阻害し得ることが示されたことから、PDGFXRはPDGF-B鎖が関与する他の疾患において有力な治療手段となり得ることが予想される。

　従来より肥厚内膜を形成する平滑筋細胞は、成体型より幼若型の平滑筋細胞に形質が類似していることが指摘されていた。今回、neointimal SMCとnewborn rat SMCにおいてのみAngII刺激でPDGF-B鎖の発現がみられたことは、形質の転換した細胞が、局所でオートクリン、パラクリン様式の増殖機構を有していることを示唆している。

　PDGF-受容体の細胞外領域(PDGFXR)をコードする遺伝子を含むアデノウイルスベクターAdenoXRを作成した。AdenoXRに感染した血管平滑筋細胞(SMC)のPDGFXRタンパク分泌は、感染後2日目にほぼ最大になり一週間後でも最大値の40%の分泌が認められた。CHO-K1細胞およびSf9細胞を用いて組換えPDGFXRを産生させるとPDGFXRはPDGF-Bと特異的に結合した。さらに組換えPDGFXRをSMCの培養上清に加えるとPDGF-BBによるPDGF-受容体のチロシンリン酸化とDNA合成能を抑制した。

　(1)ラット頚動脈バルーン障害後の血管壁への遺伝子導入効率を、大腸菌-galactosidase(LacZ)をコードするアデノウイルスAdenoLacZを用いて検討した。この結果、障害直後より障害後5日目に遺伝子を導入することにより飛躍的に遺伝子導入効率が上昇することが明らかとなった。このプロトコールに従ってアデノウイルスベクターを用いて障害血管壁に遺伝子を導入させることにより、内膜肥厚進展期に目的の遺伝子を発現させられると考えられた。

　(2)AdenoXR投与群では、アデノウイルス非投与群(内膜剥離障害(+))に比較して内膜面積が抑制され、内膜面積中膜面積比(I/M比)が43%に低下した。一方、AdenoLacZ投与群では、内膜面積およびI/M比はアデノウイルス非投与群(内膜剥離障害(+))と同程度であった。

　(3)AdenoXR投与群ではPDGF-,両受容体のチロシンリン酸化レベルは非障害血管のレベルまで抑制されたが、EGF受容体のチロシンリン酸化レベルには変化がみられなかった。AdenoLacZ投与群ではPDGF-,受容体、EGF受容体のいずれのチロシンリン酸化も抑制されなかった。

　(4)AdenoXR投与群ではAdenoLacZ投与群に比較して、内膜細胞のBrdU取り込みは著しく減少していた。中膜細胞へのBrdU取り込みもAdenoXR投与群で低下傾向がみられた。