・角膜上皮創傷治癒過程におけるTGF-シグナルとフィブロネクチンの発現の変化

　ラット角膜上皮剥離前,および剥離後12時間,1,2,7日目における角膜の凍結切片を作成した.コントロール角膜においては,TGF-受容体は角膜上皮細胞にほとんど発現されていなかった.しかし,角膜上皮剥離後12時間,1,2日目においては再生上皮細胞においてTGF-受容体の発現が増加していた.また,TGF-受容体の発現増加に伴い,細胞内におけるTGF-シグナル伝達因子であるSmad2,3,4の核への集積も観察された.また,このTGF-の作用が亢進している時期と一致して,特に再生上皮においてフィブロネクチンの発現が亢進していた.また,角膜上皮剥離後7日目においては,ほぼコントロールの状態に戻っていた.

　以上より,角膜上皮創傷治癒過程においては,TGF-作用がが亢進していることが明らかになった.さらにTGF-の作用の亢進と,再生角膜上皮からフィブロネクチンの産生が亢進には関係がある可能性が示唆された.

・培養角膜上皮細胞からのフィブロネクチン産生に関するTGF-の影響

　培養ヒト角膜上皮細胞の培養液中にTGF-を投与すると,その濃度に依存して培養液中のフィブロネクチンの発現が増加した.以上より,角膜上皮創傷治癒過程における,再生角膜上皮細胞からのフィブロネクチン産生は,TGF-の直接作用による可能性があると考えられた.すなわち,角膜上皮創傷治癒過程においては,TGF-は再生上皮からフィブロネクチンの産生を促進することで,角膜上皮の修復が適切に行われるように制御している可能性があると考えられた.

　角膜実質は,コラーゲン線維が密に規則正しく平行に配列しているために透明性が保たれていると考えられている.しかし,これまでのところ角膜実質創傷治癒過程に伴うコラーゲン線維の走行を経時的に観察した報告はない.本研究では,角膜実質創傷治癒過程に伴う角膜混濁を定量的に測定し,さらに角膜実質コラーゲン線維の配列を電子顕微鏡で観察した.

　エキシマレーザーを用いて角膜上皮と実質を定量的に切除した後に角膜混濁を定量的に測定した.角膜混濁は,術後4週間目にもっとも強くなり,その後徐々に減少していった.電子顕微鏡による観察により,コントロール角膜実質のコラーゲン線維は互いに密に配列していたのに対して,角膜切除後においてはコラーゲン線維の走行が乱れ,線維間隔が拡大していることが確認された.特に角膜切除後4週間目においては,コラーゲン線維の配列に乱れが最も顕著となり,コラーゲン線維間隔もコントロールと比べて約2倍に拡大していた.すなわち,角膜実質コラーゲン線維間隔の拡大が角膜混濁と直接関係していること,および,角膜混濁の程度とコラーゲン線維間隔拡大の程度には正の相関があることが明らかになった.

　角膜実質細胞に対してTGF-がどのような作用を有するかを検討するために,培養角膜実質細胞にさまざまな濃度のTGF-を作用させ,TGF-シグナル伝達機構と,細胞外マトリックス産生に対する影響を検討した.

　培養角膜実質細胞の培養液中にTGF-を投与すると,その濃度に依存して培養上清中におけるラミニンの発現が亢進した.また,培養角膜実質細胞にSmad2,3,4を遺伝子導入後にTGF-を作用させて,Smadの局在を免疫組織化学的に検討した.Smad2,3,4は,TGF-投与前は培養角膜実質細胞の細胞質に認められたが,TGF-投与後は核内に認められた.すなわち,角膜実質細胞にTGF-を作用させると,Smad2,3,4を介してシグナルが核内に伝達され,ラミニンなどの細胞外マトリックス産生が亢進することが明らかになった.

・角膜実質創傷治癒過程におけるTGF-シグナル伝達の解明

　エキシマレーザーを用いてネコ角膜上皮および実質を定量的に切除した.術後の角膜混濁の程度を定量的に測定したところ,術後4週間目に角膜混濁が最も顕著となり,その後徐々に減少していった.

　組織学的には,角膜混濁の最も強い術後4週間目においては,角膜切除部位の上皮直下に線維芽細胞様角膜実質細胞の増殖と,コラーゲン,フィブロネクチン,ラミニンなどの細胞外マトリックス成分から構成される異常な線維化層が認められた.免疫組織化学的には,この線維化層において増殖している線維芽細胞様角膜実質細胞においてはTGF-およびTGF-受容体の発現が亢進していた.また,Smad2,3,4の発現を免疫組織化学的に検討したところ,線維芽細胞様角膜実質細胞の核に染色が認められた.

　以上の事実より,角膜混濁の最も強い時期においては,細胞外マトリックス成分の沈着が最も顕著であり,さらに線維芽細胞様角膜実質細胞においてTGF-の作用が亢進していることが明らかになった.よって,角膜実質創傷治癒過程においては,角膜実質細胞におけるTGF-の作用が亢進することで,細胞外マトリックス産生が亢進し,これが角膜混濁を引き起こすという機序が考えられた.

　角膜実質創傷治癒過程に伴い角膜に異常な線維組織(瘢痕組織)が形成されると,視力の低下を招く.そのために,角膜実質損傷後の瘢痕組織形成を抑制するためのさまざまな努力がなされている.本研究では,一般的に用いられるステロイド系および非ステロイド系抗炎症薬が角膜瘢痕組織形成にどのような影響を及ぼすかを,in vivoおよびin vitroの実験系を用いて検討した.

　白色家兎の角膜上皮および実質を,エキシマレーザーを用いて定量的に切除した.術後には生理食塩水,0.1%リン酸ベタメタゾンナトリウム(リンデロン),あるいは0.1%ジクロフェナックナトリウム(ジクロード)を点眼した.角膜混濁の程度は,0.1%リンデロン点眼群においては生理食塩水点眼群と比較して有意に抑制されていた.それに対して,0.1%ジクロード点眼群は生理食塩水点眼群と比較して,角膜混濁に関する限り有意差を認めなかった.

　また,角膜切除後の角膜切片において,角膜瘢痕層の指標のひとつであるIV型コラーゲンの発現を調べた.IV型コラーゲンの沈着は角膜混濁の程度とよく相関しており,0.1%リンデロン点眼群においては生理食塩水点眼群と比較して有意に抑制されていたものの,0.1%ジクロード点眼群は生理食塩水点眼群と有意差を認めなかった.

　最後に,in vitroモデルにおいてステロイドのひとつであるデキサメタゾンと非ステロイド系抗炎症薬のひとつであるジクロフェナックの作用を検討した.デキサメタゾンは,角膜実質細胞からのIV型コラーゲン産生を濃度依存性に抑制した.しかし,ジクロフェナックは,角膜実質細胞からのIV型コラーゲン産生をさほど抑制しなかった.

　以上の結果より,ステロイド系抗炎症薬の点眼は,角膜実質創傷治癒過程に伴う異常な線維化を抑制するのに有用であることが明らかになった.それに対して,非ステロイド系抗炎症薬のひとつであるジクロフェナックは異常な線維化の形成には有意な影響を及ぼさないと考えられた.