C2C12細胞系において分化を誘導すると、約半分の細胞は分化して多核の筋管細胞を形成し残りは単核のまま筋幹細胞の間に存在した。多核の筋管細胞と一部の単核細胞(myocyte)はtroponin Tやskeletal myosinといった筋収縮蛋白が免疫染色で陽性であったが、多くの単核細胞はこれらが陰性であった。この不均一性をさらに調べるためにMyoDファミリー蛋白の発現を免疫染色で調べた。MyoDの発現は分化した筋管細胞とmyocyteに限られた。Myf-5、myogeninの発現も同様だった。

　分化したC2C12細胞系の細胞の増殖細胞核抗原(PCNA)とp21^WAF1の発現を免疫染色で調べた。筋管細胞とmyocyteはp21^WAF1陽性、PCNA陰性で、再び血清存在下においても、PCNA陰性だった。

　一方、未分化な単核細胞はp21^WAF1陰性、PCNAは陰性かごく弱く陽性で、再び血清存在下に置くとPCNAは強く誘導された。したがって未分化な単核細胞はゆっくり細胞周期を回っていることがわかった。

　分化した細胞系からMyoD陰性の未分化な細胞のみ選択し増殖条件で培養した。するとほぼすべての細胞がMyoD、Myf-5陽性、myogenin陰性となった。また細胞周期を活発に回っていた。これが再び分化条件下に置かれると、またもtroponin TとMyoD陽性の筋管細胞を形成した。更に、MyoD陰性の単核細胞も再び現れた。したがって分化した細胞系に現れたMyoD陰性の未分化な細胞は、MyoDを発現する能力、再び分化する能力を保持しており、適当な条件下で、分化細胞の供給源になることができると結論した。

　MyoDの発現は増殖状態のC2C12細胞のほぼすべてに見られたが、分化条件に置くと6時間後には一部の細胞で低下し、12時間後にほぼ定常状態に達した。

　myogeninの発現はMyoD発現が不均一化した後に始まり、MyoD陽性細胞でのみ見られた。不可逆的に分化のほうへ運命づけられた細胞の割合の時間経過は、myogenin陽性細胞の出現の時間経過と一致していた。ゆえにまずMyoD発現の不均一化が生じ、一部の細胞群はMyoD陰性となる。その後MyoD発現が低下しなかった細胞群で、初めてmyogeninの発現が始まり、これが最終分化への不可逆的なポイントとなり分化が進んでいく、と結論した。また、初期のMyoDの不均一化は可逆的であった。

　MyoD発現ベクターを一過性に強制発現させた細胞は分化条件下でほぼ全部分化した細胞になった。stable transformantでも、外来性のMyoDを誘導的に発現させると、非誘導時に比べて有意に高い割合の細胞がmyogenin陽性になった。この実験から未分化なまま分化能を保持した細胞になる予定だった細胞が、MyoDを発現させられたため分化する集団にまわることになり、初期のMyoDの発現の低下が未分化なまま分化能を保持した細胞を生み出していることが示唆された。

　in situ hybridization法で、上皮特異的転写因子ESE-1がマウス成体の角膜上皮に発現していることを示した。HCE2細胞系でESE-1の発現は細胞が分化するに伴い増加し、ESE-1が角膜上皮細胞においても分化と関わりがある可能性を示唆した。

　分化したHCE2細胞系も不均一な細胞集団であることに注目した。すなわち重層化した部分と単層のままの部分がみられた。そこで角膜特異的な分化マーカーのK3ケラチンの抗体染色を調べた。HCE2細胞が未分化な状態では陰性だったが、分化誘導したところ、重層化部分では陽性、単層部分ではこれが陰性であった。つまり、分化した細胞と分化しない細胞の両者が出現することがわかった。

　cell in situ hybridization法でESE-1の発現を調べた。未分化なHCE2系では、ESE-1はすべての細胞で弱く発現し、分化した系では、分化部分では陽性で未分化部分では陰性あるいは弱陽性であった。したがって分化マーカーや転写因子の発現パターンはC2C12細胞系の場合と似ていた。

　HCE2細胞にESE-1のアンチセンスRNAを強制発現させたところ、K3ケラチン発現細胞の割合は低下した。したがってESE-1は角膜上皮細胞において分化を促進する、あるいは分化に必須な条件であることが示唆された。