学位論文要旨
| No | 114595 | |
| 著者（漢字） | 加藤,大 | |
| 著者（英字） | ||
| 著者（カナ） | カトウ,マサル | |
| 標題（和） | HPLC用低分子型キラル固定相における分離機構の解析 | |
| 標題（洋） | ||
| 報告番号 | 114595 | |
| 報告番号 | 甲14595 | |
| 学位授与日 | 1999.03.29 | |
| 学位種別 | 課程博士 | |
| 学位種類 | 博士(薬学) | |
| 学位記番号 | 博薬第856号 | |
| 研究科 | 薬学系研究科 | |
| 専攻 | ||
| 論文審査委員 | ||
| 内容要旨 | 生体の構成成分や薬物などの生理活性物質の多くは光学活性体であるため、それらの分布や動態を理解するには、光学活性体の高感度かつ高選択的な分析法が必要である。その中でもHPLC-キラル固定相法は、その簡便性などの理由で生体試料中の光学異性体分析に汎用されてきた。4-Fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole(NBD-F)で蛍光誘導体化したアミノ酸(NBD-アミノ酸:図1)は、アミノプロピルシリカゲルに(S)-N-3,5-dinitrobenzoyl-1-naphthylglycine(CSP1),(S)-N-(3,5-dinitrophenylaminocarbonyl)-valine(CSP2),N-[(R)-1-(  HPLCを用いて、キラル固定相によるNBD-アミノ酸とその類似構造を有する化合物の分離係数や溶出順を調べ、光学分割に関与するNBD-アミノ酸とキラル固定相の光学活性部位との複合体形成に必要な官能基の解明を行った。その結果、CSP1では、NBD- CSP2,3の光学活性部位とNBD-アミノ酸との複合体形成にも、NBD-アミノ酸のアミノプロトン、カルボニル酸素とベンゾフラザン骨格が寄与していた。しかしながらCSP 2では、NBD-イミノ酸もNBD-アミノ酸と同じくD,Lの順に溶出する例(NBD-Pro,-N-methyl-Ala,-N-methyl-Phe)も見られたことから、NBD-アミノ酸のアミノプロトンはNBD-アミノ酸の光学分割に必須ではなく、複合体構造を安定化させていると考えられた。  次に、CSP1,2,3によるNBD-アミノ酸の分離の改善には、光学分割のみならずNBD-アミノ酸の相互分離の機構も解析する必要があると考えた。アミノプロピルシリカゲルのみを充填したカラム(APS)によるNBD-アミノ酸の溶出順は、CSP1,2,3によるものと類似していた。従って、CSP1,2,3による相互分離は、主に未修飾のアミノ基によるイオン及び水素結合に起因すると考えた。そこでシリカゲルと光学活性部位との間にアルキル直鎖を導入し、疎水的相互作用を増加させることで、CSP1,2,3の問題点であるNBD-アミノ酸の相互分離が改善されると推測し、鎖長を延長した固定相(APS,APS-6,APS-11)によるNBD-アミノ酸の相互分離を比較した。アルキル鎖長の延長により各NBD-アミノ酸は強く保持され、ピーク同士の溶出間隔が拡がったため、相互分離が改善した。3種の固定相の中で、アルキル鎖長が最長なAPS-11が最もNBD-アミノ酸の相互分離に適していた。 APS-11の末端にCSP1と同一の光学活性部位を修飾したキラル固定相(CSP4)は、移動相に5mMクエン酸メタノール溶液を用いた場合、CSP1と比較して各NBD-アミノ酸をより強く保持し、相互分離に適しており、さらに疎水性の高いアミノ酸の光学分割を改善した。生体試料の分析に汎用されている、水を含む逆相系の移動相を用いた場合、アミノ酸同士はすべて分離されたが、光学分割の分離係数は減少した。 NBD-アミノ酸以外の溶質の光学分割をCSP4とCSP1で比較した結果、アミノ酸エステル、アミド体、局所麻酔薬であるプリロカインの光学分割が、CSP4によって改善されたことから(図3)、CSP4は疎水性の高い溶質の光学分割に適していると考えられた。 さらにCSP4の光学活性部位の修飾量を半減させたキラル固定相やその構造を変化させたキラル固定相(CSP5,6)においても、アルキル直鎖導入による、NBD-アミノ酸の相互分離や疎水性の高い溶質の光学分割の改善が見られた。以上のようにアルキル直鎖を導入したキラル固定相は、従来のキラル固定相と比較して溶質を強く保持し、溶質同士の相互分離に適しているのみならず、疎水性の高い溶質の光学分割に適していた。相互分離が改善した理由は、導入したアルキル直鎖による疎水的相互作用が、溶質同士の分離に役立ったためと考えられる。光学分割能の改善には、光学活性部位のフレキシビリティーの上昇や形成する疎水空間の拡大が寄与したと予想している。  本研究により、CSP1,2,3によるNBD-アミノ酸の光学分割には、2つの水素結合と1つの | |
| 審査要旨 | 論文表題「HPLC用低分子型キラル固定相における分離機構の解析」 不斉中心を有する薬物や生体成分の分離定量にはキラル固定相を用いたHPLCが汎用される。しかしキラル固定相の多くはその分離機構が解明されていないのが現状である。本論文は、キラル固定相による蛍光誘導体化アミノ酸(NBD-アミノ酸)を始めとする多くの溶質の分離機構を、HPLCとNMRを用いて光学分割と相互分離の2つの視点から解析し、その結果に基づいて、NBD-アミノ酸の相互分離や疎水性の高い溶質の光学分割に優れたキラル固定相の作製を行ったものである。 HPLC用低分子型キラル固定相の中で、NBD-アミノ酸に対して優れた光学分割能を示す3種類のキラル固定相(アミノプロピルシリカゲルに(S)-N-(3,5-dinitrobenzoyl)-1-naphthylglycine,(S)-N-(3,5-dinitrophenylaminocarbonyl)-valine,N-[(R)-1-( 一方、これらキラル固定相における溶質同士の相互分離には、固定相の基材部分のアミノプロピル基によるイオン結合や水素結合が関与していることを明らかにした。そこで、新たにアミノプロピルシリカゲルに鎖長の異なったアルキル直鎖を修飾した固定相(APS-6-AmHA,APS-11-AmUA)を作製し、NBD-アミノ酸の相互分離を比較した結果、長いアルキル直鎖(デカン基)を修飾したAPS-11-AmUAが、疎水的相互作用が強くなるためNBD-アミノ酸の相互分離に適していた。 (2)で述べたAPS-11-AmUAの末端に光学活性部位を導入したキラル固定相(CSP4)を作製し、同一の光学活性部位を有するキラル固定相(CSP1)とその分離能を比較した結果、CSP4はその疎水的相互作用によってCSP1よりもNBD-アミノ酸の相互分離を改善するばかりではなく、疎水性の高い溶質の光学分割能を向上させることが示された。さらに光学活性部位の構造や修飾量を変化させたキラル固定相を作製し、その分離特性を検討した結果、キラル固定相にアルキル直鎖を導入することは、NBD-アミノ酸を始めとする多くの溶質の相互分離や光学分割能の改善に寄与することが判明した。これはキラル固定相の光学活性部位とアミノプロピルシリカゲルとの間に導入したアルキル直鎖が、疎水空間を形成し、その空間に取り込まれる溶質の相互分離および光学分割能を改善するためであると考えられた。これより固定相の分子認識部位の環境を変化させれば、キラル固定相による光学分割能を改善できることが判った。 以上、本論文では従来の低分子型キラル固定相の分離機構をHPLCならびにNMRを用いて解析し、NBD-アミノ酸や薬物の光学分割には、水素結合や | |
| UTokyo Repositoryリンク | http://hdl.handle.net/2261/54079 |
-naphthyl)ethylaminocarbonyl]-(S)-tert-leucine(CSP3)を化学結合させたキラル固定相により、良好に光学分割され、生体内D-アミノ酸の定量に利用されている。キラル固定相による光学分割は、溶質が固定相と形成する複合体の安定エネルギーが光学異性体間で異なることで達成される。従って、この複合体構造の解明は、各キラル固定相における光学分割可能な分子構造の解明や分離の改善につながると考えられる。一方、これらのキラル固定相を生体試料中のDL-アミノ酸分析に応用した場合、光学分割されたNBD-アミノ酸のピークが別のNBD-アミノ酸のピークと重なるため、限られたアミノ酸の定量しか出来ないという問題が残されていた。そこで私は、CSP1,2,3によるNBD-アミノ酸の分離機構の解析、ならびにアルキル直鎖を導入したキラル固定相の製作を行い、以下の知見を得た。
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