PC12細胞をDMEM増殖培地(High glucose,5%胎児牛血清,10%馬血清)または分化誘導培地TIP/DF(DMEM and F12,1:1,1%N1medium supplement,50ng/ml NGF)で培養後、細胞及び培養液のアミノ酸をメタノールで抽出し、NBD-Fで蛍光誘導体化したのち、ODSカラムさらにキラルカラム(OA2500S,OA2500R)により定性・定量分析を行った。図1に示したように、DMEMとTIP/DFの培地で培養したPC12細胞では、全Aspのうちそれぞれ14.3%(図1a)と12.4%(図1b)のD-Aspが存在していた。立体配置のみを逆転させたキラルカラムを用いて同様のサンプルを分離すると、L体とD体の流出順序が逆転したことから、D-Aspの存在が支持された(図1c)。さらに、D-Aspを立体特異的に分解するD-Asp酸化酵素(長田技大山田教授より恵与)で処理したサンプルでは、D-Aspのピークが消失したことより、D-Aspの存在が確認された(図1d)。他のD-アミノ酸(D-グルタミン酸、D-アラニン、D-セリン、D-プロリン、D-アスパラギンなど)は認められなかった。

Fig.1 Enantiomeric separation and identification of D-Asp in PC12 cells.The Asp fraction in cultured PC12 cells was enantiomerically separated by HPLC on a chiral column OA2500S.a):from DMEM-cultured cells;b):from TIP/DF-cultured cells;c):the same with b)on a OA2500R column:d):the same with b)but pretreated with D-Asp oxidase(DAO)

　上記2種類の培地でPC12細胞を4日間にわたって培養したところ、細胞内と培地中のD-Aspの含量は、培養日数と共に増加することが明らかになった(図2)。また、播種した細胞数に従って、培養期間内に生成するD-Aspの量が増加した。さらに、D-Aspの生成量はNGFによる分化誘導とは関連しないことが示唆された。培養期間中には外からのD-Aspの供給がないので、これらの結果は、PC12細胞内でD-Aspが生合成されることを示唆している。なお、mouse3T3fibroblastやhuman neuroblastoma NB-1などの培養では、D-Asp含量の増加は観察されなかった。これは、D-Aspの生合成がPC12細胞に特異的であることを示唆している。

Fig.2 Time-dependent D-Asp accumulations in the cultures of PC12 Cells Bar:SD for experiments in triplicate.^**:Signiticantly different compared to the control(0 day)P<0.01,n＝3.

　PC12細胞の培養に際して、D-Aspが細胞外で生成し(例えば共生する微生物などにより)、細胞内に取り込まれた可能性がある。しかしこの可能性は以下の実験により否定された。PC12細胞は酸性アミノ酸トランスポーターを欠如しており、培地からD-Aspを取りとり込むことができない。この性質を利用して、放射性D-Aspを添加した培地でPC12細胞を2日間培養した。図3に示したように、細胞内のD-Aspの増加は、培地中のD-Asp濃度とは無関係であった。培養期間内に培地から細胞に取り込まれたD-Aspの量は最大6pmolにすぎなかった。それに対して、細胞内には約150pmolのD-Aspが生成していた。以上の結果は、D-AspがPC12細胞内で生成することを示している。

Fig.3 Exogenous D-Asp is not taken up into the cells and has no effect on the cellular levals of D-Asp in PC12 cell cultures.Bar.SD for expenments in triplicate.^**:Significantly different compared to the control (0 day) P<0.01,n＝3.

　D-グルコースからD-Aspが生成するか否かを検討するため、高グルコース培地に馴化されたPC12細胞からグルコース欠損培地に適応できる細胞を選別し、放射性グルコースを添加した培地で培養した。得られた細胞では、L-Aspと共にD-Aspにも微量ながら放射能が検出された。また、PC12細胞のミュータントで、酸性アミノ酸を取り込むことのできる細胞を、放射性L-Aspを添加した培地で培養したところ、放射性D-Aspが検出された。これらの結果は、D-Aspの生合成前駆体がL-Aspである可能性を示唆している。

　NGF存在下で培養したPC12細胞においてアセチルコリンの刺激に応じてD-Aspが放出されることが明らかになった。同時に放出されたドーパミンの量はアセチルコリンの濃度に依存して著しく増加したのに対して、D-Aspの放出は顕著には増加しなかった。この結果はD-Aspとドーパミンの放出が異なった機構によることを示唆していると考えられる。そこで、D-Aspの細胞内局在性を、抗D-Asp抗体を用いて調べた。ヘマトキシリンあるいは7-aminoactinomycin Dによる核染色との二重染色をした結果、D-Aspの免疫反応はPC12細胞の細胞質に主に観察され、vesicle内に存在することを示す染色像は得られなかった。なお、興味深いことに、PC12細胞及びそのミュータントにおいて、D-Aspの免疫反応がすべての細胞に均一に観察されるわけではなく、個々の細胞ごとに強度に著しい差が認められた。

　上記のように、私は、キラル分離とD-Asp酸化酵素処理を利用してPC12細胞におけるD-Aspの同定を行い、哺乳類細胞におけるD-Aspの生合成を初めて証明した¹⁾。生合成ルートについては、L-Aspが前駆体である可能性を示し、刺激に応じたD-Aspの細胞外への放出及び細胞内の分布を検討した。PC12細胞はラット副腎髄質褐色細胞腫由来のものであり、神経分泌細胞のモデルとして、神経あるいは分泌細胞の機能の解析に広く利用されている。今後、PC12細胞におけるD-Aspの生合成経路、放出機構および生理作用の解明が期待される。これにより、哺乳類体内におけるD-Aspの生理的意義に関する研究がより進展するものと考えられる。