脳組織にNADase活性が存在することは古くから知られていたが、リンパ球分化マーカーとして同定されたCD38/NADaseとの関連は不明瞭であった。そこで、ラットCD38に対する抗体を作成し、脳でのCD38の分布とNADase活性との関連を調べた。胎性ラット脳初代培養におけるCD38の発現量は主にアストロサイトにおいて高く、それに対応して高いNADase活性も認められた。また、ゲル内でNADase活性を測定する新規の方法(in gel NADase assay法)を用いて解析したところ、アストロサイトのNADaseは分子量約46kDaのCD38であることを同定できた(Fig.1)。

Fig.1 アストロサイトのNADaseがCD38であることの確認(in gelNADase assay法を用いて)NAD⁺はNADaseにより分解されるとADP-riboseとなり、蛍光強度を増すために、NADaseをバンドとして検出できる。この方法を用いてアストロサイトのNADaseを解析したところ、抗CD38抗体immunoblotのバンドと一致し.CD38のNADase活性を抑えるZn²⁺存在下でバンドが消失したことから、脳のNADaseがCD38であることが確認できた。

　さらに、蛍光誘導体を用いたin gel NADase assay法を応用して、インタクト細胞の表層上のNADaseを可視化することに成功した(Fig.2)。今回用いた方法は未知のNADaseを解析する上で有用なtoolとなると考えられる。

Fig.2インタクト細胞表層上のNADase活性の可視化NAD⁺の蛍光誘導体(NAD⁺)を用い、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。アストロサイトの細胞表層上には強いNADase活性が見られたが、CD38を発現していないニューロンではほとんど見られなかった。矢印はニューロンの存在箇所を示す。

　アストロサイトのNADaseはCD38が担っていることが明らかとなった。そこで、アストロサイトのCD38/NADaseの特性を検討するうえで、基質であるNAD⁺を添加してみた。すると、NAD⁺処理時間と共に細胞表層上のimmunoreactiveなCD38が消失していくことがわった(Fig.3)。これと同時に、NADase活性の低下(不活性化)が見られた(Fig.4)。この現象は、CD38の反応生成物では見られず、またnicotinamideを類似化合物に置き換えたNAD⁺誘導体(基質とならない誘導体)でも見られなかった(Fig.5)。したがって、CD38は基質分解過程で(product inhibitionとは異なる機構で)特異的に不活性化することが明らかとなった。このとき、detergentで可溶化時のCD38の局在の変化、NADase活性の回復は見られず、また、internalizationにたいする抑制剤の効果が見られなかったことからinternalizationでは説明できないと考えられた。さらに、immunoreactiveなCD38の量は変化していないこと、CD38の分子量は変化していないことから、CD38のdegradationでもないと考えられた。

Fig.3NAD⁺の添加により細胞表層のimmunoreactiveなCD38は消失する。ラットアストロサイトにNAD⁺を添加して0〜18時間培養後、1次抗体に抗ラットCD38pAb、2次抗体にFITC-抗ウサギIgGmAbを用いて染色し共焦点レーザー顕微鏡により観察した。NAD⁺を添加後、経時的に細胞表層のimmunoreactiveなCD38が消失していく様子が認められる。

Fig.4アストロサイトにおけるNADaseの不活性化NAD⁺の処理時間、処理濃度依存的に細胞表層上のNADaseが不活性化を起こしたが、この現象はCD38の反応生成物では起きない(product inhibitionとは異なるメカニズムの可能性)。

Fig.5基質依存的な細胞表層のNADaseの不活性化〜NAD⁺類似化合物を用いて〜100MのNAD⁺類似化合物をアストロサイトに添加し、18時間培養してから細胞表層のNADaseを測定した。CD38の基質となる化合物のみNADaseの不活性化を引き起こしている。

　そこで、CD38の精製標品を用いてNADaseの不活性化を調べた。精製したCD38をNAD⁺で処理し、in gel NADase assay法により解析したところ、細胞の時と同様にNADaseの不活性化が見られた(Fig.6左)。つまり不活性化にはコファクターを必要としなかった。不活性化についてさらに情報を得るために等電点電気泳動による分離を試みたところ、不活性化したCD38は、劇的に塩基性側に移行していた(Fig.6右)。これはCD38のチャージが変化したことを示しており、CD38が化学的修飾をうけている可能性を示唆する。このような修飾は現在のところ知られていないため、注目に値する。

Fig.6CD38精製標品を用いたNADaseの不活性化と性状変化CD38精製標品をNAD⁺により不活性化させ、in gel NADase assay(左)あるいは等電点電気泳動(右)により解析した。不活性化したCD38では等電点がbasic側にシフトしているspotが検出された.

　ここまでのことから、CD38はアストロサイトの表層にも存在し、化学的修飾によるNADase活性調節機構を備えていることが明らかとなった。しかし、CD38のNADaseのproductの役割は未だ明らかになっていない。そこで、productのうちADP-riboseの役割について解析した。

　ADP-riboseが細胞内で、還元糖となりhistonのアミノ基に修飾を付加する反応が知られており、advanced glycation end products略してAGE化proteinを形成する(Fig.7)。一方、細胞外では主にglucoseがAGE化の基質となることが知られている。AGE-proteinはAGEレセプターに結合するほか細胞外matrixに結合し、老化や血管系の病気に関与することが示唆されている。ここで、ADP-riboseとglucoseとではどちらがAGE化の基質となり易いのかを調べたところ(Fig.8)、ADP-riboseはglucoseよりも良いAGE化の基質となることがわかった。このことから、細胞外に酵素活性を向けたCD38は、glucoseよりも、AGE化能の高いADP-riboseを生成することで、細胞外のAGE化を促進している可能性を考えた。

Fig.7細胞内外におけるAGE化とCD38の細胞外のAGE化供与体としての可能性細胞内ではヒストンがADP-riboseによりnon-enzymaticに修飾をうけAGE化される。一方、細胞外ではglucoseがAGE化の基質となり、様々なタンパクがAGE化をうける。

Fig.8glucoseとADP-riboseで、どちらがAGE化の基質になり易いかの検討glucoseあるいはADP-riboseをBSAとともにincubationし、AGE化されたBSAを抗AGE-BSA抗体で検出した

　そこで、BSAをモデル基質として用い、NAD⁺ならびにCD38の精製標品とともにincubationし、AGE化を抗AGE-BSA抗体で評価した。すると、NAD⁺のみではBSAのAGE化はおこらないが、CD38が加わるとAGE化の促進が見られた。

　さらにこのAGE化促進の現象が実際の細胞表層に存在するCD38によっても起こるかどうかを確認した(Fig.9)。NADase強さ、つまりはCD38の発現量に応じて細胞外のAGE化の促進が認められた。

Fig.9細胞表層のCD38/NADaseによるAGE化の促進THP-1/CD38 stable cloneをBSA、50Mのヌクレオチド存在下で培養し、culture medium中のBSAのAGE化の度合いを抗AGE-BSA抗体により検出した。CD38の発現量つまりはNADase活性の強さに応じ、NAD⁺存在下でAGE化が促進される

　このことより、CD38は酵素活性を細胞外に向け、glucoseよりも高いAGE化能を持つADP-riboseを作り出し、細胞外の蛋白質のAGE化を促進していると考えられた。

　CD38の酵素として役割以外に、CD38のリガンドないしはレセプターとしての役割に注目した。今までに、抗CD38抗体を用いたCD38の解析が行われてきたが、生理的な相互作用分子についてはあまり明らかになっていない。そこで、CD38と相互作用する分子の検索をFar western blot法を用いて行った。

　CD38のN末端にFLAG tagを付加したCD38を作成し、manmalianの細胞に発現させこれをprobeとした。また、tunicamysin処理により糖鎖修飾のないFLAG-CD38も準備した(Fig10A)。これらをmembraneに吸着させた蛋白質とともにhybridizeさせ、probeを固定した後、抗FLAG抗体によってprobeを検出した。すると、コントロールには見られないないいくつかのバンドが検出され、その中でも、約50kDaのバンドがspleenの膜画分で強く検出された(Fig.10B)。この50kDaのバンドは、脳や、血球系細胞株であるHL60細胞では弱かったことから、組織特異性のある分子と考えられた。さらに、このバンドは糖鎖修飾のないCD38では検出できなかったことから、糖鎖が結合に重要であることもわかった。今後、この分子の同定が、CD38の更なる機能の解明の糸口になると考えられる。

Fig.10CD38と相互作用する分子の検素〜Far western blot法を用いて〜Far western blot法の模式図(A)。ラットspleen膜画分に約50kDaのバンドが強く検出された(B)。また、このバンドは糖鎖修飾の無いCD38では検出されなかった。

　新たに見いだされた、50kDaの相互作用分子は結合にCD38の糖鎖を必要とすることが示唆された。CD38にはアミノ酸配列から予測される、4つのN-結合型糖鎖が存在するが、この糖鎖のCD38へ寄与は重要と考えられる。

　そこで、CD38のNADaseに対するレクチンの影響を調べた。糖の種類に特異性のあるいくつかの代表的なレクチンを、CD38とともにincubationし、NADase活性を測定したところ、レクチンは濃度依存的にNADaseを抑制した(Fig11)。さらに、tunicamysin処理により、糖鎖修飾を無くしたCD38に対しては、レクチンの作用が消失したことより、レクチンが確かに糖鎖に結合して抑制をかけていることが明らかとなった。これらのことより、CD38にたいするレクチン様細胞外成分の存在とその関与が期待される。

Fig.11レクチンによるCD38/NADase活性抑制〜糖鎖修飾の影響〜レチノイン酸によってCD38の発現誘導をかけたHL-60細胞膜画分を各レクチンとともにincubationし、NADase活性に対するレクチンの影響を調べた。レクチンはCD38のNADaseを抑制したが(右図)、tunicamysin処理により、糖鎖修飾をなくしたCD38(inseL 36kDa)においては、レクチンによるNADase活性抑制効果は消失した(左図)。RCA120;ricin120,AAL;alcuria aurantia,WGA;wheal germ agglutinin,ConA;Concanavalin A

　CD38はリンパ球ばかりではなく、脳のアストロサイトにも存在する分子であることから、その働きは多岐にわたる可能性を秘めている。その中の機能の一つとして、CD38の持つNADaseは、AGE化を促進する働きを持つ可能性が示唆された。そして、CD38/NADaseは化学的な修飾による非可逆的、あるいはレクチン様物質による可逆的活性調節機構によって調節されるというユニークな特性を持っていることが明らかとなった。また、これらの酵素活性に関する機能に加え、CD38と相互作用する分子が存在することから、この分子の新たなシグナル伝達因子あるいは細胞接着因子として役割が期待される。

まとめ

　脳組織にNADase活性が存在することは古くから知られていたが、このNADaseが分子量約46,000のCD38に起因することを明らかにし、またその局在についてはアストロサイトに高く発現していることを見出した。この同定において、ゲル内でNADase活性を測定する方法(in-gel NADase assay法)や無傷細胞の表層上でNADaseを可視化する方法などの新規の解析方法が開発されている。

　アストロサイトにCD38/NADaseの基質であるNAD⁺を添加すると、その処理時間に依存して細胞表層上のimmunoreactiveなCD38が消失し、同時にNADase活性が低下(不活性化)することを見出した。この現象は、CD38の反応生成物あるいはnicotinamide部分を置換した基質とならないNAD⁺誘導体では認められず、CD38は基質分解過程で(product inhibitionとは異なる機構で)特異的に不活性化することが示された。CD38の不活性化は単なる"internalization"では説明できず、CD38分子が細胞表層上での酵素反応過程で化学的修飾をうけ、陽性の電荷を帯びることを明らかにした。

　細胞外ではglucoseがタンパク質のアミノ基に修飾を加え、advanced glycation end products(AGE)を形成することが知られており、老化や血管系の病気に関与することが期待されている。一方、ADP-riboseはAGE化の供与体となるばかりでなく、glucoseよりもはるかにAGE化の基質として適しているという知見を得た。したがって、CD38のNADase活性が果たす役割の一つとして、NAD⁺から生成したADP-riboseがAGE-proteinを増加させる可能性を検討した。CD38の基質を含む条件下で、CD38発現細胞を培養したところ、CD38の発現量に伴い細胞外蛋白質のAGE化の促進が確認された。

　CD38と相互作用する分子をFar western blot法により解析し、ラット脾臓の細胞膜画分中に分子量約50,000のタンパク質を見出した。この分子との結合は、CD38の糖鎖部分を必要とした。そこで、CD38の糖鎖の重要性を探る目的から植物レクチンをモデルとしてCD38のNADaseに対する影響を検討し、レクチンがNADase活性を抑制することを見出した。これらの結果は、CD38に対してリガンドあるいはレセプターとして機能し得る生理的なレクチン様分子が存在し、CD38の酵素活性が細胞表層で調節される可能性を示唆している。

　以上を要約するに、本論文は新しい視点からCD38に関わる機能を解析し、CD38がリンパ球系の細胞以外に、脳のアストロサイトにも存在し、細胞外においてタンパク質のAGE化を促進する作用をもつ一方、基質分解時に非可逆的に、あるいはレクチン様物質により可逆的に調節されるというユニークな特性をもつことを明らかにしている。また、これらの活性制御に関わる知見に加えて、CD38と相互作用する分子を同定している。さらに、これらの研究過程でin-gel NADase assay法や、細胞表層上でのNADase活性の可視化など、独自の解析方法を開発している。これらの研究成果は、今後CD38をはじめとする種々のエクト型酵素の機能を解明する上で重要な知見を与えるものであり、博士(薬学)の学位として十分な価値があるものと認められる。