granulocytinの一次構造を完全に決定するために、5’RACE法を用いて未決定の塩基配列を含むクローンを得た。さらに新規に決定した配列をprobeとしてcolony hybridazationを行うことで、granulocytinの全アミノ酸配列を含むクローンをNIH-Sape 4cDNA libraryから単離した。得られたcDNAは624bpのinsertを含み、173個のアミノ酸からなるopen reading frameを有していた。予想されるアミノ酸配列には、決定したアミノ酸配列が全て含まれていた。他の蛋白と相同性を調べた結果、ハエから得られた2つの分泌性カルシウムイオン要求性レクチン(Sarcophaga lectin,Drosophila lectin)と比較的高い相同性を有しており、約25%のアミノ酸が糖認識配列内で一致していた。

　次にgranulocytinがレクチン活性を実際に有するか知るために、血球凝集活性について解析した。その結果granulocytinはウサギ赤血球をカルシウムイオン存在下で凝集することが明らかになった。なお認識糖を知るために、凝集活性を阻害する糖を検索したが、特に特異的に阻害するものは存在しなかった。

　granulocytinは体液細胞から見いだされかつレクチンであることから生体防御因子として機能する可能性が考えられる。私はそれを検証する手がかりを得るために発現解析を行った。最初にgranulocytinが生体防御器官である脂肪体、体液細胞どちらで合成されるか知るため、Northern blot解析を行った。その結果、granulocytinは体液細胞で主要に合成されていていることが明らかになった。そこで生体防御機構が活性化した際にgranulocytinの応答性が存在するか知るために、体表傷害後0、6、24時間経過したセンチニクバエ3齢幼虫より採取した体液細胞のRNAに対してNorthern bolt解析を行った結果、granulocytinの遺伝子発現は体表傷害することで有意に増大することが示された。この結果はgranulocytinが生体防御時に機能し得る分子であることを示唆している。

　次に20kDa蛋白(granulocytin)の生体内の発現部位をを知るために、正常なセンチニクバエ3齢幼虫より採取した組織に対して、immunoblot解析を行った。その結果granulocytinは予想された体液細胞だけでなく、体液中に常在することが明らかになった。またどのサブタイプの体液に存在しているかについても解析した結果、顆粒細胞(granulocyte.ほ乳類では好中球に相当する)に局在することが明らかになった。これらの結果から20kDa蛋白(granulocytin)は顆粒細胞で合成され体液中に常在することが明らかとなり、初期免疫に寄与している可能性が考えられた。

　さてgranulocytinの実際の機能は現在のところ不明であるが、体液性のレクチンであることから考えて、外来の異物を認識して他の体液細胞を活性化するなどの機能を予測している。しかし昆虫類を用いた活性化検出系の構築は困難であるため、その実証は今のところできない。

　ところでこのような基本的な防御機能は、いわゆる先天性免疫というものの中に含まれることが考えられ、生物種を越えて広く存在することが予想される。そこで私はgranulocytinが生物種を越えて他の生物種の生体防御細胞を活性化する作用を持つ可能性を考え、いくつかのレクチンにより活性化することが報告されているマウスマクロファージの系を用いてgranulocytinの解析を進めた。

　いくつかのレクチンについて、その量的依存にマクロファージによるglucose代謝が促進することが示唆されている。そこでそれを指標としてgranulocytinのマウスマクロファージ培養細胞J774.1に対する活性化効果を調べた。その結果、granulocytinにはJ774.1に対する有意な代謝亢進能が存在することが明らかになった。さらにマクロファージにより合成される炎症性サイトカインであるTNF,IL-6を指標にして、活性化効果について解析した。その結果、granulocytinはTNF,IL-6の産生を誘導する効果を、既知のレクチンと同程度有することが明らかになった。これら3つの指標から、granulocytinはJ774.1を活性化する機能を有することが明らかになった。

　granulocytinの作用メカニズムとして、細胞表面の糖鎖を認識して作用することは容易に予想できる。そこでN型糖鎖合成阻害薬であるtunicamycinをJ774.1に加えてone turn over以上培養することにより糖鎖合成を停止させた条件で、granulocytinによるTNF誘導に影響が見られるか解析した。その結果、TNF誘導能はtunicamycin処理によりほぼ完全に抑制されることが明らかとなった、その際細胞の生存率には殆ど影響が見られないことから、tunicamycinにより細胞全体の代謝・合成が抑制されたのでなく、granulocytinによる活性化が特に抑えられたと考えられる。これらの結果はgranulocytinが細胞表面上の糖鎖を認識するなどの機構によってJ774.1の活性化を行っている可能性を示唆している。

　本研究で私は、センチニクバエの活性化した体液細胞を、認識する抗体の対応抗原として見いだし、精製した20kDa蛋白(granulocytin)の一次構造を完全に決定し、新規のカルシウムイオン要求性レクチンであることを示した。さらにgranulocytinが体表傷害時(生体防御機構活性時)に遺伝子発現が増大することも明らかにした。またこのレクチンが種を越えてマウスマクロファージ様培養細胞をを活性化する作用を有することを明らかにし、さらにその作用に細胞上の糖鎖が必要である可能性を示した。

　今後の課題としてはマウスマクロファージ上の結合因子を同定すること、及びgranulocytinの機能的ホモログをほ乳類から得ること等の方法で、ほ乳類におけるレクチンによる活性化機序を明らかにすることをまず挙げる。さらに、結合因子のホモログをセンチニクバエから単離するなどの手法でgranulocytinの昆虫生体内における役割を明らかにすることについても行うべきであると考えている。