癌の発生、進行および転移形成に伴い癌細胞が悪性度が増す過程で、細胞表面分子や細胞内分子の発現に変化が起こる。硫酸化ムチンは、糖鎖の末端に硫酸基が付加したムチン(O-結合型糖鎖を多く含む高分子量糖蛋白質)であり、大腸癌の進行に伴って発現量が減少する。

　モノクローナル抗体91.9Hはヒト大腸組織の粗精製硫酸化ムチンを免疫原とし作製された。この抗体の結合性はヒト正常大腸上皮組織で高く大腸癌原発巣では低く、肝転移巣ではほとんどの症例で結合性が失われている。ひとつの原発腫瘍内では浸潤部の方が結合性が低い。

　胃上皮では91.9H抗体のエピトープは発現していないが、腸上皮化性や腫瘍化に伴い検出されるようになる。また胆管、気管などの上皮にも発現がみられる。潰瘍性大腸炎や嚢胞性線維症、胆肝結石症に伴い発現量が変化することも知られている。

　これまで、大腸癌細胞における91.9H抗体の反応性が癌の進行に伴い減少する原因は不明であった。この抗体のエピトープは硫酸基が含まれていること以外には構造が不明であり、大腸癌の進行に伴って減少している抗原の構造、機能、抗原の減少する機構など、全く未解決であった。

　91.9H抗体の認識するエピトープ構造を明らかにするため、91.9H抗体と様々な構造既知の糖鎖との結合性を比較した。ポリアクリルアミドで重合されビオチン化された各種オリゴ糖のポリマーと91.9H抗体の結合性を、表面プラズモン共鳴(SPR)を利用したバイオセンサーおよびELISA法を用いて測定した¹⁾。図1に示すように、91.9H抗体は硫酸化ルイスa抗原(図2;HSO₃-3Gal1-3(Fuc1-4)GlcNAc)に強く結合し硫酸化ルイスX抗原には結合しなかった。ルイスa、ルイスX、それらのシアル化体にも結合しなかった。硫酸化ルイスaに対する解離定数K_DをSPRを利用したバイオセンサーで求めたところ、5.3x10^-8(M)であった。

図1:ストレプトアビジンのコートされたチップに対する、ビオチン化オリゴ糖のポリマーとそれに続く91.9H抗体の結合のセンサーグラム

図2:硫酸化ルイスa抗原

　硫酸化ルイスa抗原のフコース残基をスミス分解により分解し、SPRを利用したバイオセンサーで91.9H抗体との結合を測定したところ、K_Dが約20分の1に減少していた。結合阻害ELISA法において、硫酸化ルイスa1残基のオリゴ糖より24残基のオリゴ糖のポリマーの方が、硫酸化ルイスa1残基に対する91.9H抗体の結合性が約770倍高かった。合成糖脂質を用いた解析では、硫酸化ルイスa、さらに還元末端にガラクトースの付加した構造、それにさらにグルコースの付加した構造の順に91.9H抗体の結合性が上昇した²⁾。

　組織学的研究において、ルイス式血液型陽性の個体の大腸上皮のゴブレット細胞において91.9H抗体の強い染色像が得られたが、N-アセチルグルコサミン残基の4位にフコース残基を付加する酵素の欠損した、ルイス式血液型陰性の個体の大腸上皮では、ほとんど91.9H抗体で染色されなかった(図3)¹⁾。

図3:91.9H抗体を用いた上行結腸上皮組織の免疫染色 (a)ルイス式血液型陽性の個体、(b)ルイス式血液型陰性の個体。線は100mを示す。

　以上より、91.9H抗体は硫酸化ルイスa抗原を認識し、硫酸化ルイスa抗原のクラスター形成、骨格の伸長により結合性は上昇し、フコース残基の消失により結合性は減少することが判明した。

　硫酸化ルイスa抗原がヒト大腸癌細胞においてどのような形で提示されているか調べた。19種類のヒト大腸癌細胞株(HCCP-2998、LS174T、GEO、CBS、HCT-15、HT-29、KM12C、MOSER、C、DLD-1、HCT116、SW480、RKO、Omega、DiFi、SW620、LoVo、HCC-M1410、HCC-M1544)において、硫酸化ムチンと91.9H抗体により認識される硫酸化ルイスaの産生を調べた³⁾。細胞を[³⁵S]-Na₂SO₄を用いて代謝標識し、細胞抽出液をコンドロイチナーゼABC、ヘパリチナーゼIで処理することでプロテオグリカンを分解した。これを電気泳動し高分子量画分の放射活性を検出することで、硫酸化ムチンの産生を調べた。19種類のうち16種類のヒト大腸癌細胞株が硫酸化ムチンを産生していた。Western blot法により、16種類のうち8種類のヒト大腸癌細胞株が91.9H抗体により認識される硫酸化ルイスaを産生してることがわかった。硫酸の取り込みのみられない細胞では抗体の結合はみられなかった。

　さらに硫酸供与体の生成阻害剤である塩素酸塩、またはO-結合型糖鎖伸長阻害剤であるBenzyl--GalNAcの硫酸化ルイスa抗原産生に対する影響を調べた。各薬剤存在下でLS174T細胞を培養することで、[³⁵S]-Na₂SO₄の取り込みで示される硫酸化ムチンの産生量は減少し、91.9H抗体の結合性で示される硫酸化ルイスa抗原の産生量も減少した。[³H]-threonineの取り込みを指標に、ムチンのコアとなる蛋白質の産生量は変化していないことを確認した。以上より、LS174T細胞の産生する高分子量糖蛋白質のO-結合型糖鎖に硫酸化ルイスa抗原が含まれていることがわかった。

　一方、特定のムチンコア蛋白質に硫酸化ルイスa抗原が提示されている可能性を考え、19種類のヒト大腸癌細胞株のムチンコア蛋白質(MUC1、MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6)の遺伝子発現をRT-PCR法で検出した⁴⁾。

　91.9H抗体エピトープの発現量を低下させることにより悪性度の上昇した細胞が生じるかを確かめるため、以下の実験を行った。ヒト大腸癌細胞株LS174TをDimethyl Sulfoxide、または塩素酸塩、またはBenzyl--GalNAc処理することにより、91.9H抗体の結合性が減少した細胞を作製した⁵⁾ 。処理または未処理細胞をヌードマウスの脾臓へ注入し肝転移を観測したところ、予想に反し、91.9H抗体の結合性減少に伴い肝転移能はむしろ低下していた。

　LS174T細胞の肝転移能の高い亜株とLS174T細胞では、91.9H抗体の結合性は変わらないことも考慮し、91.9H抗体のエピトープの発現が低い癌細胞が転移性が高いわけではないと結論づけた。

　LS174T細胞をヌードマウスの盲腸に移植して得た腫瘍塊原発巣とこれに由来する肝転移巣をホルマリン固定後薄切し、免疫組織学的検討を行った³⁾。91.9H抗体のエピトープは盲腸原発巣のみで発現がみられた。ヒト大腸癌細胞株DLD-1でも肝転移巣における91.9H抗体結合性の消失はみられた。以上より、大腸癌細胞が肝転移を形成する際に、肝臓内微小環境からの影響で91.9H抗体エピトープの発現が抑制されていることが示唆された。

　91.9H抗体の認識する抗原が硫酸化ルイスaであることを示した。ヒト大腸上皮組織より大腸癌原発巣が、さらにこれより肝転移巣の方が硫酸化ルイスa抗原の発現が少ないことがわかった。またこの現象は、硫酸化ルイスa抗原が大腸癌の肝臓への転移に抑制的に作用するためではなく、肝臓微小環境における因子による硫酸化ルイスa発現の抑制の結果であることを示唆した。現在、硫酸化ルイスa抗原の生合成および肝臓微小環境での発現抑制の機構を解明するため、硫酸化ルイスa抗原の生合成の鍵となる硫酸基転移酵素の遺伝子クローニングを行っている。

　硫酸化ルイスa抗原は、各種上皮系癌の腫瘍マーカーであるシアリルルイスa抗原の、シアル酸の付加位置に硫酸が付加した構造であり、両者は生合成の段階で競合関係にあると考えられる。また硫酸化ルイスa抗原は、炎症時の白血球の集積の際に重要な働きをする接着分子E-セレクチンのリガンドとなり得る。さらに最近H.pyloriと結合する可能性が示され、感染との関連も注目されている。本研究の結果は、癌の転移のみならず、生体内で多様な機能を持つと考えられる硫酸化ルイスa抗原の解析に貢献できるものと考えている。