Ce(NH₄)₂(NO₃)₆(10mM)存在下におけるジペプチドGly-Phe(10mM)の加水分解のHPLCチャートをFig.1に示す。アミノ末端に蛍光物質を結合させて検出するo-phthalaldehyde(OPA)法を用いたところ、分解生成物として、等量のGlyおよびPheが得られた(Fig.1(a))。さらに、酸化的開裂によって生じる副生成物が反応溶液中に存在しないことを¹H-NMRにより確認した。Ce(IV)は酸化剤として知られているが、pH7.0,50℃の反応条件では切断反応は完全に加水分解として進行することが明らかになった。また、検出方法としてUV吸収を用いた場合は、分解生成物以外にジペプチドの環化反応によるcyclo(-Gly-Phe)の生成が確認された(Fig.1(b))。これは末端のカルボキシル基とアミノ基間での分子内縮合により生成したものである(Scheme1)。しかしcyclo(-Gly-Phe)の生成量は分解して生成するアミノ酸の生成量に比べてはるかに少なく、pH7.0,50℃という温和な条件でGly-PheはCe(IV)によって効率的に加水分解されることが明らかになった。

Fig.1 HPLC patterns for the hydrolysis of Gly-Phe catalyzed by Ce(IV)at pH 7.0 and 50℃ for 1 day(a)and 2 days(b).

Scheme 1

　種々のジペプチドもGly-Pheと同様にCe(IV)により加水分解された(Table 1)。反応速度はアミノ酸の種類に顕著には依存しないが、正電荷を側鎖に有するアミノ酸(Arg,Lys)を含むジペプチドの場合は加水分解が抑制される傾向にある。また、全ての基質において切断反応は加水分解で進行し、環化反応はほとんど起こらなかった。

Table 1 Rate constants for the dipeptide hydrolysis catalyzed by Ce(IV)at 50℃ and pH7.0^a.

　Ce(IV)によりGly-Pheの加水分解が温和な条件で効率的に進行したのに対して、末端のアミノ基およびカルボキシル基を保護したジペプチド(CBZ-Gly-Phe,Gly-Phe-NH₂,CBZ-Gly-Phe-NH₂およびcyclo(-Gly-Phe)は同じ条件下ではいずれも加水分解は全く起こらなかった。ゆえに、Ce(IV)による効率的なジペプチドの加水分解においては末端のアミノ基とカルボキシル基が重要な働きをすることが明らかになった。

　一方、Gly-Phe-NH₂と同じく末端のカルボキシル基を保護したAsp-Phe-NH₂の加水分解は促進され、pH8.0,50℃において72時間後には40%が分解された。ゆえに主鎖のカルボキシル基の役割は側鎖のカルボキシル基によって代わりうることが示唆された。

　種々の金属イオンの加水分解活性を比較した結果をFig.2に示す。希土類イオン(La(III)〜Y(III))はいずれも高い切断活性を示し、その中でもCe(IV)の切断活性が顕著に高いことが明らかになった。また、Ce(IV)と同じく高電荷であるZr(IV),Hf(IV)も高い加水分解活性を示すが、これらは環化反応も著しく促進させた。Ce(IV)での環化反応の転化率は金属イオン非存在下とほぼ同程度に低いため、加水分解の触媒としてCe(IV)が優れた性質を有することが明らかになった。

Fig.2 Catalytic activities of various metal ions for the hydrolysis(the open bars)and cyclization(the closed bars)of Gly-Phe at pH7.0 and 80℃ for 24 h:[Gly-Phe]₀＝[metal salt]₀＝10mM.The corresponding metal chlorides were used,except for Ce(NH₄)₂(NO₃)₆.

　中性以上の水溶液中ではCe(IV)は水酸化物ゲルとして沈殿する。反応の活性種を判定するため、不均一溶液を遠心分離し、上澄みと沈殿のそれぞれにおける加水分解活性を調べた。すると、上澄み溶液に基質を添加しても反応は全く進行せず、逆に沈殿に基質溶液を添加すると反応が進行した。これより、反応の活性種は上澄みに溶存するイオンではなく、Ce(IV)の水酸化物ゲルであることが明らかとなった。

　また、pH7.0においてCe(NH₄)₂(NO₃)₆(50mM)の水酸化物沈殿にGly-Phe(10mM)を加えたところ,70%の基質が沈殿に取り込まれることがHPLCにより分かった。これは基質のジペプチドがCe(IV)水酸化物沈殿に取り込まれることによって反応が進行することを示している。

　このようにCe(IV)による加水分解反応は不均一系で進行するが、反応の経時変化は擬一次速度式に良好に適合した。また、Ce(NH₄)₂(NO₃)₆を2mM、Gly-Pheを10mMで反応させたところ、48時間後に転化率が44%になり(turnover 2.2)、Ce(IV)が触媒として作用していることが明らかになった。さらに、反応速度のpH依存性を検討したところ、pH6.5〜8.0の領域で反応速度はpHに依存せず一定になった(Fig.3)。

Fig.3 The pH-rate constant profile for the hydrolysis of Gly-Phe(10mM)by Ce(NH₄)₂(NO₃)₆(10mM)at 50℃.

　反応機構についての知見を得るために,ジペプチドがPr(III)と相互作用することによって生じるランタニド誘導シフトを¹H-NMRで測定した。Pr(III)はペプチド加水分解活性を有しながら中性条件でも均一系となるため、反応機構の検討に適している。Gly-Phe(20mM)とPrCl₃(20mM)の系において得られたランタニド誘導シフトをFig.4に示す。pDが2.0から5.7に上がるにつれて主にカルボキシル基側のPheの-CH,-CH₂のピークが低磁場側にシフトした。続いてpDを5.7から6.8に上げると、さらにアミノ基側のGlyの-CH₂のピークが低磁場シフトした。またpD>6.8の領域ではpD6.8で得られたシフトとほぼ同じシフトのままであった。これらの結果は中性領域でGly-Pheが希土類イオンに主鎖のアミノ基とカルボキシル基の両方で配位することを示す。また、中性条件におけるランタニド誘導シフトのPr(III)濃度依存性のグラフより、Gly-PheとPr(III)の錯生成定数K＝1.3×10³M^-1が得られた。

Fig.4 Lanthanide-induced ¹H-NMR shifts(ppm)(D₂O270MHz)of Gly-Phe(20mM)by Pr(III)(20mM).pD＝2.0(a),5.7(b)or 6.8(c).

　同様に、pD3.0においてAsp-Phe-NH₂,Gly-Phe-NH₂,Asp-Phe,Gly-Pheについて得られたランタニド誘導シフトをFig.5に示す。酸性条件では主鎖のアミノ基がプロトン化するため、Gly-Phe-NH₂,Gly-PheにおけるGlyの-CH₂にシフトはわずかしか見られない。一方、Asp-Phe-NH₂,Asp-PheにおいてはAspの-CH,-CH₂に大きなシフトが見られた。これは、Aspの側鎖のカルボキシル基がPr(III)と相互作用をしていることを示している。Ce(IV)によりAsp-Phe-NH₂がGly-Phe-NH₂よりも効率的に加水分解されたのは、主鎖のカルボキシル基の配位能が失われても側鎖のカルボキシル基で相互作用して、切断されるペプチド結合の近傍にCe(IV)が固定されたからと考えられる。

Fig.5 Lanthanide-induced ¹H-NMR shifts(ppm)of the dipeptides(20mM)by Pr(III)(20mM)at pD3.0.

　ジペプチドが主鎖のアミノ基とカルボキシル基とでCe(IV)に配位することにより、ジペプチドとCe(IV)水酸化物ゲルの複合体が生成する(Scheme2)。基質がAsp-Phe-NH₂の場合は主鎖の代わりに側鎖のカルボキシル基が配位する。その結果、反応中心のカルボニル炭素がCe(IV)の近傍に固定される。次にCe(IV)の配位水酸基がこれを求核攻撃し、四面体中間体が生成する。Ce(IV)の大きな正電荷がカルボニル基を効率的に立ち上げ、かつ負電荷をもつ遷移状態を静電的に安定化する。ペプチド結合の加水分解における律速段階は、四面体中間体からのアミノ基の脱離である。このとき、Ce(IV)が一般酸触媒として働き、脱離基を安定化して反応を加速していると考えられる。

Scheme 2

　Ce(IV)が顕著に高い活性を示す理由として、配位座がフレキシブルで多数(8〜9個)であることと、大きな正電荷を有するために強い酸触媒となることが挙げられる。