リポソームに包埋されたバクテリオロドプシン(bacteriorhodopsin,bR)が光照射により作り出すpH濃度勾配を用いて,ドーパミン(dopamine,DA)をリポソーム内に濃縮した.ラサロシドA(lasalocid A,Las)とbRを小さな一枚膜リポソーム(sma11 unilamellar vesicles,SUVs)の膜に再包埋した.バクテリオロドプシンは光依存性のプロトンポンプである.Fig.1で示したように光照射で再構成リポソームの内側にプロトンを輸送する.形成されたpH勾配をエネルギーとしてキャリヤーのLasがDAをリポソームの中に能動的に輸送し,濃縮する.SUVを含む溶液の中に30M DAを溶かした.DAの濃度変化はcyclic voltammetry(CV)で観測した.結果をFig.2に示す.bRとLasが両方存在する時,溶液中のDAの85%が濃度勾配に逆らいSUVの中に輸送され,354倍濃縮された.本研究結果と既報の類似のLas系でバッファー溶液による形成される pH 濃度勾配をエネルギーとして DAが能動輸送された結果をTable 1に示す.小さい受容/供与体積の比率を与えるリポソームと連続的に輸送エネルギーを供給できる bR を使用することで輸送と濃縮の効率が著しく促進されることが分かった.

図表Fig.1.Principle for DA uptake into liposome. / Fig.2.Concentration of DA into liposomes constructed with Las and bR(○,●),with Las(■),with bR(□),without both Las and bR(△).All under illumination but(●).

Table 1.Comparison of receiving/feed volume ratios,percent uptake and efficiencies for concentration with different uphill transport systems

　MRP(multidrug resistance-associated protein)は多剤耐性(multidrug resistance,MDR)を示す膜蛋白の一つである.MRPは各種の抗癌剤など多くの基質をATP依存的に細胞外に輸送するため(Fig.3),癌治療の大きな障害となることが知られている.したがって,MRPの基質に対する選択性の評価はMDRを克服することにおいて非常に重要なことである.従来の方法ではMRP膜ヴェシクルを調製し,ATPと基質をヴェシクル溶液に入れ,基質のヴェシクル内への輸送を行なう.そしてヴェシクルを分離し,取り込められた基質(殆どの場合は放射性標識体)を測定する.この方法にはいくつの欠点が存在する.基質の受動拡散と脂溶性基質の膜内への溶け込みが避けられず,さらに速度論的研究の場合バルク溶液中の基質が輸送されることにより起こる濃度の変化が誤差をもたらす.本研究ではATPの消費速度を指標としてMRPの基質に対する選択性の評価法を開発した.MRPヴェシクル溶液中に表面活性剤(Triton X-100)を加え,ヴェシクル内外の溶液を均一化にした.そしてMRPの輸送によるATPの消費を以下の反応によりNADHの酸化反応過程より評価した.

　NADHの濃度変化は340nmで測定し,得られたATP消費速度はMichaelis式で解析した.実験は典型的なMRPの4種類の基質を用いた.MRPの最良の基質として知られるLTC4(Cisteinyl leukotriene C4)のLineweaverプロットをFig.4に示す.このプロットからMRP蛋白と各基質の親和性を表わすKm値を得た(Table 2).各基質に対するKm値は文献値と一致し,しかも親和性の序列LTC4>LTD4>LTE4>>GSSGと一致することが分かった.本法は従来法の欠点が克服され,リアルタイムの速度論的データでMRPの基質に対する選択性を評価できること分かった.以上の結果を踏まえて,MRPの基質として知られる二種類の抗癌剤,ダウノルビシン(Daunorubicin,Dau)とヴィンクリスチン(Vincristine,Vin)のKm値を同様に求めた.結果をTable 2に示す.

図表Fig.3.ATP-dependent MRP transport activity. / Fig.4.Lineweaver plot for LTC4.

Table 2.Km values of substrates for MRP

　本研究は2種類の膜能動輸送蛋白を用いて,生物活性物質の分離とスクリーニングを行った.バクテリオロドプシンは光照射で間断なくプロトン勾配を維持し,ドーパミンを効率よくリポソームの中に濃縮させることに成功した.このような小さな受容体積を持ち,生体系のように連続的に輸送エネルギーを供与できるシステムは能率的な分離と濃縮が期待できよう.一方MRP蛋白質において膜輸送時のATPの消費速度を通じてMRPの基質に対する選択性を評価した.この方法を使い従来法の欠点を避け,基質のMRPに対する親和性を求められることを示した.従来法はMRPの輸送能力を輸送された様々な基質の絶対量を測定するのに対して本法は各ヶの基質の輸送過程に共通するATPの消費を指標としてMRPの基質に対する選択性を評価した.本法はMRPの基質のスクリーニングに応用し,抗癌剤の開発に貢献するものと期待される.