私はこれまでにマウス胎児由来細胞株m5S/1Mに対して作成したモノクローナル抗体群の一つ3A10によりラットにおいて生後3週までの間に発現の増大する脳特異的な蛋白質群が検出されることを見いだしている。この時期はラットにおいて神経系成熟の最終段階であるシナプス形成及びミエリン形成の盛んな時期にあたる。そこで私はこの抗原群が上記の過程に関与している可能性を考え同定を試みた。同定したうちの一つはシナプスの主要蛋白質であるシナプシンIa/bであった。もう一つはアミノ酸780aaからなる新規分子であった。そこでこの新規分子をNadrin(Neuron-associated and developmentally-regulated protein)と名付けた。アミノ酸配列上の情報より、Nadrinは3つのドメインからなると考えられた。1つはアミノ酸240残基からなるN末側の領域であり、ここには蛋白質間の相互作用に関わる構造であるcoied-coilが3か所存在した。2つめはその隣にある低分子量G蛋白質のRho-familyに対するGTPase活性促進蛋白質(Rho-GAP)の活性ドメインである。Rho-GAPはRho-familyの活性型から不活性型への変換を促進することから、NadrinがRho-familyの活性調節を介してアクチン系細胞骨格の制御に関わる可能性が示唆された。3つめは320残基からなるC末側の領域である。この領域には既知の蛋白質とのホモロジーは認められなかったが、セリン、スレオニン、プロリンが豊富であり、構成アミノ酸の約50%を占めるという特徴を有していた。また連続する29個のグルタミンが存在した。これらはいずれも転写調節因子の転写活性化ドメインによく見られる特徴である。以上のことからNadrinはアクチン系細胞骨格のダイナミクスから遺伝子発現への橋渡しという非常にユニークな機能をしている可能性が考えられた。

　Nadrinの抗ペプチド抗体を作成し、ラットでの発現の分布、時期を検討した。10週齢のラットより腎臓、肺、胸腺、脾臓、副腎、肝臓、脳を採取し、臓器分布を調べたところ脳にのみ発現が認められた。次に成長に伴う発現の変化を調べた。胎生19日目の脳では発現は認められなかった。そこで生後3、8、14、21、28、70日目の大脳皮質、小脳、海馬、嗅球での発現を調べた。いずれの部位でも生後発現を開始し、3週齢までに成体と同様の発現量に達することが確認できた。さらにNadrinが発現している細胞の種類を調べるため胎生15日目のラット大脳皮質由来の神経細胞、グリア細胞それぞれの初代培養を行ない、培養15日目の細胞でのNadrinの発現を調べた。その結果グリア細胞には存在せず、神経細胞においてのみ発現が認められた。以上のことからNadrinは生後発現を開始し、脳内で広範に発現している神経細胞特異的分子であると考えられた。

　Nadrinの機能解析の手ががりを得るため、PC12を用いて細胞内分布の検討を試みた。作製した抗体は細胞染色には向かなかったため、遺伝子導入により発現させたgreeen-fluorescence protein(GFP)融合蛋白質(Nadrin-GFP)の分布を調べた。GFPと異なり、Nadrin-GFPは核を除く細胞全体に散らばる斑点状の分布を示した。そこでNGF刺激により神経突起の伸長を促したNadrin-GFP発現細胞を分泌小胞上の蛋白質であるシナプトタグミンの抗体で染色し、分布を比較した。その結果、Nadrin-GFPは神経突起の先端部においてのみシナプトタグミンと同様な局在をしていると思われた。さらにNadrinのN末端からGAPドメインまでを含む部分(Nhalf-GFP)及びC末端側の領域のみ(Chalf-GFP)をそれぞれ発現させて分布を調べた。Nhalf-GFPはNadrin-GFPとよく似た分布を示したことより、Nadrinの分布を決めている構造はNhalfのなかに存在すると考えられた。一方Chalf-GFPは核に局在が観察された。

　神経突起の先端部にNadrinが存在していたことから、シナプス小胞のサイクルに関わっている可能性を考えた。そこで調節性開口放出にNadrin関与するか否かをPC12からの大型有芯小胞(LDCV)からの分泌で検討を行なった。PC12では遺伝子導入により発現させた成長ホルモン(hGH)はLDCVに集積し、種々の刺激によりノルエピネフリンと同様に分泌される。従ってhGHと他の遺伝子を共発現させ、刺激によるhGHの放出を測定することによりその遺伝子の開口放出への影響を測定することができる。この系を使用して高カリウム刺激でのhGHの放出に対する影響を検討した。刺激によるhGHの細胞外液への放出はGFPを共発現させた場合には変化がなかったが、Nadrin-GFPの共発現により約15%増大した。またNhalf-GFPの共発現によっても、同様の効果が見られた。このことよりNadrinは伝達物質放出に関与している可能性が示唆された。また開口放出の促進にはC末側の領域は必要ではないと思われた。Rho-GAPドメインを除いたN末側の領域のみを共発現させると、hGHの放出は約20%阻害された。従って開口放出の促進にはRho-GAPドメインが必要であると考えられた。また、阻害がみられたことはN末側の領域がドミナントネガティブ的に働いたことを示している。このことから、N末側の領域も開口放出に関わっていると考えられた。

　本研究において私は新規分子Nadrinを見出し、成長に伴い神経細胞特異的に発現する分子であることを示した。さらにPC12細胞においてNadrinの過剰発現により大型有芯小胞(LDCV)からの分泌が増大することを示し、Nadrinが神経終末からの伝達物質の放出に関わっている可能性を示唆した。実際に伝達物質の放出に関わる一連の過程にNadrinがどの様に関わっているのかは今後の課題である。しかし、構造上の特徴からアクチンとの関連が強く示唆されることから、伝達物質放出におけるアクチンネットワークの再構築に関与している可能性が考えられる。今回の解析ではC末側の領域の役割については不明であるが、この領域のみを細胞に発現させると核に局在がみられることや、一次構造上の特徴より、転写調節に関わる可能性が考えられた。実際にそのような機能を有するとすれば、Nadrinは伝達物質放出による遺伝子発現の調節に寄与しているのかもしれない。したがって、神経系の可塑性への関与という観点からも興味深い役割を担っている蛋白質である可能性もあると考えている。