ホタテガイ殻体中の可溶性タンパク質は,分子量の異なるものが8種類存在し、SDS-PAGEによって推定されたそれらの分子量はそれぞれ150,125,104,77,49,42,40,15kDであった。PAS染色の結果、8種類全てが糖タンパク質であり、Stains-All染色の結果、150,125,104,77kDの4種に陽イオン結合能があることが示唆された。イタヤガイ殻体中の可溶性タンパク質は,分子量の異なるものが4種類存在し、それらの分子量は77,49,42,18kDであった。PAS染色の結果、18kD以外の全てが糖タンパク質であることがわかった。一方、アズマニシキ殻体中の可溶性タンパク質は,分子量の異なるものが3種類存在し、それらの分子量は65,30,17kDであった。PAS染色の結果から、ホタテガイやイタヤガイのものとは異なり、いずれも糖タンパク質ではないことが示唆された。

　ホタテガイから検出された104,77,49kDの3種類のタンパク質のアミノ酸配列をエドマン法により解析した結果、決定されたN末端18残基のアミノ酸配列は全て共通であることがわかった。また、イタヤガイについても77,49,42kDの3種類で決定されたN末端13残基のアミノ酸配列は全て共通であった(図1)。アズマニシキについては、17kDのタンパク質についてのみ、N末端8残基のアミノ酸配列を決定した(図1)。

　ホタテガイとイタヤガイは、分子量が一致する糖タンパク質を3種類(77,49,42kD)共有する。さらに2種は、N末端配列がそれぞれ共通で、分子量の異なる複数のタンパク質が存在するという点で類似性がある。アズマニシキの殻タンパク質は、分子量、糖鎖の付加の有無において他の2種のものと異なる。しかし、決定されたN末端の配列は3種間で類似しており、一つおきに酸性アミノ酸が配置するという共通の特徴を有する(図1)。

図1 ホタテガイ、イタヤガイ、アズマニシキの殻内可溶性タンパク質のN末端アミノ酸配列。太字は酸性アミノ酸、星印はホタテガイと共通のアミノ酸残基を示す。アミノ酸の一文字表記は、図2の説明を参照。

　3種の殻内可溶性タンパク質のN末端には、一つおきに酸性アミノ酸が配置するという共通した特徴があることから、酸性アミノ酸がカルシウムイオンと相互作用している可能性がある。

　ホタテガイの外套膜より抽出した全RNAからcDNAを合成し、上述のN末端アミノ酸配列に基づいて作成したプライマーを使用して、RACE法によりMSP-1をコードするcDNAの全長を増幅させた。また、得られたDNA断片をクローン化して塩基配列を決定し、MSP-1の全アミノ酸配列を明らかにした。得られたcDNAは2978塩基対(bp)あり、5’末端から35 bpの部位に開始コドンが、2555 bpの部位に終始コドンが存在する。2927 bpの部位にポリA付加シグナルと予測される配列(ATTAAA)が存在し、2952 bpの部位からポリA尾部が始まる。開始コドンから60 bP下流からエドマン法で決定されたMSP-1のN末端配列が始まる。N末端の上流20アミノ酸は、シグナル配列と考えられ、その中には13残基の疎水性アミノ酸が含まれる。

　シグナル配列を除いたMSP-1のアミノ酸配列は820残基からなり、その分子量の理論値は74.5kDである。また、計算によって求められた等電点は3.2で、MSP-1は典型的な酸性タンパク質であると言える。MSP-1のアミノ酸組成は、セリン、グリシン、アスパラギン酸の割合が高く(それぞれ32,25,20%)、これまでに報告されたホタテガイその他の二枚貝類の殻内可溶性タンパク質全体のアミノ酸組成のデータとよく一致することから、MSP-1は殻内可溶性タンパク質の主成分であることが示唆される。

　MSP-1は上述したように酸性タンパク質であると考えられ、その場合SDS-PAGEによる見かけの分子量は、実際のそれより大きくなることが知られている。さらにMSP-1は糖鎖の付加やリン酸化などの翻訳後修飾を受けていると考えられるので、SDS-PAGEのゲル上の77,104,125,150kDのバンドの中の一つがMSP-1を示していると考えられる。

　本研究で明らかにしたMSP-1の一次構造は、中央部に良く保存された4つの繰り返しユニットを持った"反復モジュール構造"をしていることが大きな特徴である(図2)。-ヘリックス構造をしていると予測される酸性のN-terminal domainに続いて、K-G-x-xというモチーフが5回繰り返すBasic domainが存在する。中央部に4回繰り返すユニットは、それぞれ3つのドメイン(SG domain,D domain,G domain)から成る。SG domainは巻貝の殻内不溶性タンパク質であるLustrin AのGS domainとの類似性が認められる。それはターン構造に富むと予測され、柔軟性をもつ構造である可能性がある。D domainはユニットの中でも特に保存性が高く、MSP-1の中で最も重要なドメインであると考えられる。リン酸化および糖鎖付加の可能性のある配列はこのD domainに集中している。D-G-S-DまたはD-S-Dという繰り返しモチーフを含み、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸(D)がカルシウムイオンあるいは他の塩基性アミノ酸などと相互作用をすることが推察される。一方、従来可溶性殻内タンパク質に存在し、殼体形成時に鋳型の役割を果たしていると予想されていた(D-x)nというモチーフは、D domain(およびMSP-1の他のドメイン)には見いだされなかった。また、酸性アミノ酸にはアスパラギン酸とグルタミン酸の2種類があるが、MSP-1の他の酸性ドメインに比べてD domainにはアスパラギン酸が圧倒的に多く、負に帯電したカルポキシル基の位置の正確さが要求される機能を担っていることが予想される。G domainはその中心に塩基性アミノ酸が集まった部分があり、酸性アミノ酸を含むドメインと相互作用する可能性が考えられる。

図2.MSP-1のモジュール構造。数字はアミノ酸残基の位置、太字は酸性アミノ酸。G glycine A alanine V valine L leucine P proline F phenylalanine E glutamate H histidine S serine T threonine N asparagine K lysine Q glutamine Y tyrosine D aspartate R arginine

　軟体動物の殻内可溶性タンパク質は、(1)結晶成長の阻害(2)結晶成長の鋳型(3)結晶多型(カルサイト/アラゴナイト)の制御(4)硬組織の強度の増加(5)酵素(炭酸脱水素酵素など)としての機能、等の役割を果たしていると考えられてきた。この内の(1)と(2)について、MSP-1の構造から予想される、殻体形成過程の二つのモデルを議論する。

　ホタテガイの殻体外層は、図3に示すようなカルサイトの単結晶からなる葉状構造を示す。面Bと面Cでは結晶成長が起こらず、面Aのみが成長する結果、このような形の結晶が形成されると考えられる。また、D domain中のアスパラギン酸は規則的に配列しており、MSP-1が立体構造を取ったときに、アスパラギン酸は2次元的な広がりを持って規則的に配置されることが予想される。この場合、D domainは(110)面と(101)面の片方のみに、特異的に吸着する可能性がある。

図3.ホタテガイの葉状構造カルサイトの結晶の模式図。数字は 菱面体晶形の面指数。

　1)D domainが(110)面に特異的に吸着する場合

　まず不溶性タンパク質のシートが形成され、その間で結晶が成長する。面Cは不溶性タンパク質と接しているため、成長しない。面AとBはMSP-1を含んだ外套膜外液と接しており、MSP-1は(110)面である面Bのみに吸着し結晶成長を阻害する。その結果、面Aのみが成長し、葉状構造の単結晶が形成される。

　2)D domainが(101)面に特異的に吸着する場合

　1)と同様に、不溶性タンパク質のシートの間で結晶が成長し、そのために面Cは成長しない。面AとBは外套膜外液と接しており、面BはMSP-1以外の可溶性タンパク質が吸着することにより成長が阻害されている。MSP-1が外套膜外液に分泌されると、MSP-1は(101)面である面Aに吸着して結晶成長を阻害する。MSP-1のG domainが基質(たとえば不溶性タンパク質)と相互作用することにより、MSP-1は基質にシート状に覆われる。再びMSP-1が分泌されると、G domainが基質に吸着することにより、D domainは外套膜外液側に配置される。規則的に配置されたアスパラギン酸が外套膜外液中のカルシウムイオンを吸着して結晶成長の核を生成し、(101)面の成長が開始される(この場合に形成される有機質膜は、いわゆるサンドイッチモデルと符号する)。

　今後、MSP-1の抗体を使って、MSP-1の殻体中の分布を調べることにより、このモデルのどちらかが妥当であるかを明らかにすることができると考えられる。