転写反応、特に転写開始反応は遺伝情報の本体であるゲノムから必要な情報を選択してmRNAの合成を時間的かつ空間的に制御させる段階であり、遺伝子発現調節機構において中心的な役割を果たしていると考えられる。転写基本因子TFIIEは転写開始反応に必須な因子であり、TFIIHの転写開始複合体への分子集合またはTFIIHの酵素活性の調節機能を持つことが報告されている。一方、一本鎮DNAへの結合能、DNAヘリックスの安定性とTFIIEの要求性との関連から、TFIIEは転写開始段階のプロモーターオープニング過程に関わり、TFIIHとは独立して転写開始段階で機能する可能性が示噴されてきたが、その作用機構については明らかにされていない。報告者は転写開始機構における転写基本因子TFIIEの機能的役割を解明することを目的として酵母two-hybrid法を用いてTFIIEと相互作用する因子の検索を行い、単離した因子とTFIIEとの相互作用解析及びその相互作用の機能的役割の解祈を行った。

　TFIIE相互作用因子の検案の結果、出芽酵母の細胞周期因子Cdc68pのとトホモログが単離された。出芽酵母Cdc68pはG1/S移行段階で作用するCLN1,CLN2の転写活性化因子であるSWI4を始めとする数多くの遺伝子の発現に必要な細胞周期因子であることが報告されている。また、Cdc68はクロマチン構造変換を介した転写調節活性を持つことが遺伝学的研究によって示唆されているがその分子機作は判明していない。一方、DNAヘリックスの安定性は生体内のクロマチン構造変換により多大な影響を受けることから、TFIIE-Cdc68間の相互作用はクロマチン構造とTFIIEの機能が密着に関連していることを示唆している。

　本研究において報告者は、第一に出芽酵母Cdc68pのヒトホモログ遺伝子をTFIIEの相互作用因子として単離し、TFIIEがCdc68と相互作用することを示した。第二に、TFIIE-Cdc68間の相互作用が出芽酵母でも保存されていること、及びこの相互作用が細胞内において機能的であることを遺伝学的及び生化学的な方法を通して明らかにした。これによりクロマチン構成因子であるCdc68が転写基本因子TFIIEを介して転写調節を行うという今までにない新しい転写調節様式モデルを提示した。第三に、Protein kinase CKIIがCdc68のリン酸化を介してTFIIE-Cdc68相互作用を調節することをin vitro実験を通して示した。本知見により、G1/S移行でその活性が急激に変化することが知られているprotein kinase CKIIがCdc68のリン酸化を通してTFIIE-Cdc68間の相互作用を調節し、これによりCdc68の細胞周期制御活性が発揮されうるというモデルを提示した。

　本研究では、クロマチン構造変換を通して転写調節活性を持つことが遺伝学的に報告されているCdc68pと転写基本因子TFIIEが生化学的に相互作用すること、また遺伝学的的な解析から、両者の相互作用が生体内において機能的であることを初めて明らかにした。本知見を踏まえて報告者は、クロマチン構成因子Cdc68が転写基本因子TFIIEとの相互作用を通して転写開始段階に作用するモデルを提示した。本モデルはクロマチン構造変換に関わるクロマチン構成因子が転写基本因子TFIIEと直接的に相互作用することにより転写調節を行うという今までにない新しい転写調節様式を提示している。さらに、またCdc68がProtein kinase CKIIによりリン酸化を受け、TFIIEとの相互作用活性が調節されることをin vitro実験を通して示した。本知見はTFIIE-Cdc68間の相互作用が細胞周期において重要な役割を担うことを示唆するだけでなく、protein kinase CKIIによる細胞周期の制御様式を分子レベルで説明しうる点でも意義深いと言える。

　従来のTFIIE研究は裸のDNAを鋳型とした転写系を用いた解析が中心であった。報告者はTFIIEのクロマチンDNAからの転写調節反応における機能を理解するためにTFIIEに相互作用するクロマチン関連因子をtwo-hybrid法を用いて検索した。

　ヒトcDNAライブラリーを用いたtwo-hybrid法によりTFIIE-の相互作用因子を検索した。48個のcDNAクローンからクロマチン構造変換に関わる出芽酵母CdC68pと55%の相同性を示し、進化上高度に保存されているCDC68を解析対象として選択した。出芽酵母CDC68遺伝子はヒストンの変異体の表現型と類似しているSPT16遺伝子としても単離されている。従ってTFIIEとCDC68の相互作用解析により新規のクロマチン転写調節様式を明らかにできると考えた。

　本報告はヒトCDC68の単離の最初の報告で、高い相同性を示すショウジョウバエホモログであるdre4のORFの約90%に対応する領域であった。核移行シグナルが863aa-869aaに存在することから、TFIIE-との相互作用が核内で行われ得ることを示峻している。またCDC68mRNAはヒト全組織において発現していることから、CDC68の機能が基本的なものであると考察した。

　in vitro結合検出法によりCDC68がC末側領域を介してTFIIE-と直接相互作用し、さらにCKIIによるCDC68のC末側領域のリン酸化がこの相互作用を抑制することを示し、リン酸化によるTFIIE-CDC68間の相互作用調節と細胞周期調節遺伝子の発現に関与するモデルを提唱した。また、CDC68とヒストンH1、H2A、H2Bとの選択的結合をも生化学的に示し、クロマチンとの直接の間係を明らかにした。

　Cdc68pとTFIIEとの相互作用は出芽酵母においても保存されていた。TFIIE-の低温感受性変異体にCdc68pを過剰発現すると表現型を抑圧した。この低温感受性型蛋白質および野生型に対するCdC68pの結合能を検定した結果、低温感受性型TFIIE-はCdc68pとの結合能を失った。上記実験結果はTFIIE-とCdc68pの機能的相互作用を示している。

　今後、1)TFIIE-CDC68間相互作用がクロマチン構造を介した転写の活性化あるいは抑制化またはその両方に作用するのか、その調節機能がどのような分子機構により行われているのか、2)CKIIがTFIIE-CDC68間の相互作用をin vivoにおいても調節しているのか、を追求することによりクロマチン転写におけるTFIIE、CDC68、CKIIの3者の役割を明らかにできる。また3)CDC68が細胞周期因子でもあることから、CDC68を通したクロマチシ転写と細胞増殖、発生、分化の関係を追求できる。

　TFIIE相互作用因子としてクロマチン因子CDC68を単離した。この因子が組織全般に発現していること、出芽酵母CDC68では生育に必須な遺伝子であること、および進化的高保存性を有することから、基本的な転写調節機能を担うと考察した。次にCDC68のC末側領域とTFIIE-の特異的・直接的な相互作用がCKIIによるCDC68のリン酸化により制御を受けることを示し、TFIIE-CDC68間の相互作用を介した細胞周期調節モデルを提唱した。CDC68のC末側領域のヒストンに対する結合を示した上でCdc68pとTFIIEが機能的に相互作用することを示した。本研究で得られた知見はクロマチン因子CDC68が転写基本因子TFIIEを介して転写調節する可能性を世界に先駆けて示す最初の報告である。

　なお、本論文第5章の一部は、共同研究により行われたが、論文提出者が主体となって分析および検証を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。

　したがって、博士(理学)の学位を授与できると認める。