本来ろ胞細胞刺激ホルモン(FSH)の分泌を抑制する蛋白として単離されたフォリスタチンは、アクチビンに特異的に結合する因子である。フォリスタチンは中胚葉誘導能などの様々なアクチビンの活性を中和・抑制する機能を持ち、アクチビンの拮抗因子と考えられる。ツメガエル初期発生においては、フォリスタチン(XFS319)はいわゆるオーガナイザー領域、及び脊索中胚葉に発現し、また過剰な人為的発現により直接神経組織を誘導することが報告されている。これらの結果は、フォリスタチンが初期胚の前後軸形成において重要な役割を持つことを示している。フォリスタチンはシステイン残基に富む4つの特徴的アミノ酸配列を含み、これをフォリスタチンモジュールと呼ぶが、このモジュールの機能については不明である。最近、マウス培養細胞を用いた研究でTGF-b1により発現が誘導される新規の蛋白として、TSC-36が単離された。これはフォリスタチンモジュールを含む306アミノ残基からなる分泌蛋白であり、続いて単離されたヒトのFRP、ニワトリのFlikと共にフォリスタチン関連蛋白(FRP)ファミリーに属すると考えられる。ニワトリでの研究で、Flikはフォリスタチンと基本的に類似した発現を示すにもかかわらず別々に発現調節されている事が示唆されたが、その機能については全く分かっていない。

　そこでまず、FRPの機能を解明するためにアフリカツメガエルのFRP(xFRP)の遺伝子クローニングを行い、発現解析を行った。ステージ24-26のツメガエル胚からcDNAライブラリーを作成し、マウスTSC-36のEcoRI/EcoRI断片2637bpをプローブとしてスクリーニングした結果、299アミノ残基をコードするxFRPのほぼ全長を含む、約2.5kbのcDNAクローンが得られた。予想されるアミノ酸配列をマウスTSC-36・ヒトFRP・ニワトリFlikと比較したところ、それぞれ70%・71%・68%の相同性を示した。N末端側のフォリスタチンドメインの比較ではより高い、およそ95%の相同性を示し、特徴的なシステイン残基の位置は完全に保存されていた。フォリスタチンモジュールをXFS319と比較した結果、xFRPはXFS319と比べて2つのアミノ酸が欠け、結果的に糖鎖修飾サイトが失われていることが明らかになった。この欠失は、フォリスタチンとFRPとの機能の差に何らかの関連がある可能性がある。

　さらにノザンブロット解析によりツメガエル発生過程におけるxFRPの発現量の変化を調べた結果、原腸陥入後のステージ11あたりから微かに発現が始まり、神経胚にかけて発現が増加し、その後はオタマジャクシに至るまでほぼ一定に強い発現を示すことが分かった。また、DIGラベルプローブを用いたホールマウント加in situハイブリダイゼーションにより、各ステージ胚内の部域的発現について詳細に調べた結果、以下のような結果が得られた。xFRPは原腸陥入開始時のステージ10にはオーガナイザー領域で発現し始めており、これはXFS319と同様である。さらにxFRPは原腸陥入の進行と同時に予定脊索領域で発現し、そこに接する形で生ずる神経誘導と同時に神経板の予定底板領域に限局した発現を見せる。発現は脊索領域で特に著しく、後期神経胚までは脊索全域にわたってはっきりとした発現を続ける。さらに脊索下索の分化とともに脊索下索へも発現が広がり、神経管の底板領域での発現もそのまま維持される。脊索での強い発現は、神経胚の終わり頃から胚中央部より徐々に薄くなり、それとともに神経底板及び脊索下索での発現が強められるが、この現象は脊索の分化の終了に伴う体央部からの空胞化と軌を一にしている。またこの頃には体節領域でもわずかにxFRPの発現がみられる。幼生では脊索でのxFRPの発現はほぼ失われ、さらに神経底板・脊索下索でも同様の現象がみられ、結局頭部及び尾部の先端に発現を残すのみとなる。これらの発現様式は、XFS319のそれといくつかの点で違いがあった。すなわち、XFS319は脊索の分化においてまず前方で発現し徐々に後方へと発現が移動するのに対し、xFRPははじめから脊索全域で強く発現している事、また、XFS319が前脳でも発現しているのに対し、xFRPは後脳の底板までしか発現していない事、さらにXFS319は脊索での発現が消えないのに対し、xFRPは興味深い弱まりを見せる、等の違いである。以上の結果は、両者ともに神経軸の形成に深い関わりを持つが、その部域化の調節において明らかに異なる役割を果たしていることを示唆するものである。そこでさらにxFRP cDNAをもとにmRNAを合成し、マイクロインジェクションによりツメガエル胚の腹側・背側のそれぞれに過剰発現させ、発生に与える影響をみようと試みた。その結果、xFRPの異所的発現は正常発生に特に影響を与えないことが分かった。また、脊索・神経マーカー遺伝子の発現の変化を、動物極へのインジェクションとアニマルキャップアッセイ・RT-PCRを用いて調べた結果も同様であり、やはり何ら影響を与えないことが確認された。

　さらに、他の成長因子によるxFRPの発現変化をアニマルキャップアッセイとRT-PCRによって調べた結果、xFRPはアクチビン10ng/ml以上の濃度で処理した場合、発現が増加することが確認された。しかし、xFRPはbFGF処理によってもわずかに発現が増加することも示された。またさらに、動物極側割球への各中胚葉・神経誘導因子の合成mRNAインジェクション後にアニマルキャップを切り出し、RNAを抽出しRT-PCRを行うことで、それらの中胚葉・神経誘導物質によるxFRPの発現変化についても確認した。その結果、xFRPはオーガナイザー因子であるnoggin・follistatin、中胚葉マーカーであるXbrachyuryによって発現が増加するが、脊索マーカーであるホメオボックス因子、Xnotによっては影響を受けないことが確認された。これらの結果、xFRPは中胚葉・神経の誘導に伴って発現が増加するものの、少なくともXnotの下流では調節されていないことが明らかになった。今後はxFRPの機能阻害実験によりその機能を探るとともに、分泌タンパクであるxFRPと直接結合する因子の探索等を軸に、その直接的な機能と発現調節機構を解明する必要がある。

　最近、アクチビンType-II受容体の細胞内ドメインに結合する因子の一部(ARIP1)がマウスでのTwo-Hybrid法を用いた研究により発見された。アクチビン下流でシグナル伝達を担うSmad2は、Type-I受容体の細胞内ドメインのキナーゼによるリン酸化の結果Smad4に結合して核内へ移行すると考えられているが、このARIP1はType-II受容体に直接結合するという点で興味深いものである。そこで、ツメガエルホモログ、xARIPのクローニングを行った。得られたcDNAの配列は4159bpで、2つのWWドメインと5つのPDZドメインを含む1116アミノ残基をコードするORFをもち、予想されるアミノ酸配列はマウスARIP1と比較して約84%の相同性を示し、特徴的なドメインも保存されていた。xARIP遺伝子の一部に対する特異的プライマーを用いたPCRの結果、xARIPは母性由来でmRNAとして存在し、原腸陥入の進行と共に減少し、初期尾芽胚から胚由来の発現が始まる事が明らかになった。さらにホールマウントin situハイブリダイゼーションにより発現の分布状況を確認した結果、xARIPは胞胚期には局在がみられないものの、神経胚後期から脳・眼・糸球体に限局した発現をし始めることが分かった。眼においては神経胚後期のレンズ形成に際してレンズに発現し、レンズの分化が進むに従って網膜細胞へと発現が移動する。脳における発現はほぼ一様だが、発現は神経管外側の予定運動ニューロン領域から始まると考えられる。また、特に強い発現を示す領域として、前腎管より内側に存在する糸球体があげられる。

　xARIPのORF全長に対するmRNAを合成しマイクロインジェクションを行ったところ、胚発生に与える影響は特に確認されなかった。そこで、ARIP1のアクチビン受容体への結合に直接関わると考えられる領域(5番目のPDZドメイン)をベクターへ組み込み、mRNAを合成してマイクロインジェクションを行った。その結果、8細胞期の背側に発現させた場合、発生過程で原腸陥入が阻害される他、セメント腺の形成に異常が見られ、高濃度の条件下では頭部構造が欠損する胚が生じた。このフェノタイプはxARIPの5番目のPDZドメインをコードするmRNAのマイクロインジェクションによっても同様に見られ、発生する割合もほぼ一致した。またこれらの胚では、頭部における眼・脳の分化そのものはほぼ正常であったが、咽頭内胚葉の著しい欠損により、頭部構造の各器官の配置に特に異常が見られた。予定咽頭内胚葉領域は、原腸陥入において陥入してゆくオーガナイザー領域の先端に相当する領域であり、この領域の分化不全が起きたと考えると、陥入の遅れと頭部構造の異常が統一的に説明できる。これらの結果より、ARIPタンパクは予定咽頭内胚葉の分化と原腸陥入に関わるほか、発生後期においては中枢神経系や腎臓に関わる組織・器官の形成に関与していると考えられる。また、発生後期でxARIPが発現している各器官の分化そのものにははっきりとした影響が認められなかったが、これはマイクロインジェクションしたmRNAが、発生後期まで効果を持続しにくい為である可能性もある。今後は、トランスジェニック等の実験によって発生後期における機能についてさらに詳細な知見が得られるものと期待される他、Smadとの関わりについてさらなる解析が必要とされる。