様々な多細胞生物の体において特定の器官や細胞が規則正しく配置されている。このようなパターンは発生過程において何らかの位置情報が与えられ、各細胞がそれを正確に解釈することによって実現するものと考えられる。このような位置情報からパターン形成に至るメカニズムを探ることは発生生物学上の重要な課題であったが、近年は様々なモデル生物系において分子レベルでの解析が急速に進んだ。中でもショウジョウバエにおける研究はこの分野に大きく貢献しており、パターン形成に関わる様々な遺伝子が単離されたが、それらはMorphogenとして働く分泌性蛋白質、その受容体、その下流のシグナル伝達系の構成因子、その標的となる転写因子などをコードしていた。ショウジョウバエの強力な遺伝学的手法を用いてこれらの遺伝子の役割を解析することによって位置情報とパターン形成の具体的なイメージを描くことが可能となった。

　ショウジョウバエの成虫背中には規則正しく剛毛が生えており、位置情報とパターン形成のメカニズムを解析する上での優れたモデル系と考えられる。感覚器官である剛毛の形成する位置はほぼproneural遺伝子であるachaete-scute(ac-sc)の発現と対応している。ハエの背中はiroquois(iro),pannier(pnr),wingless(wg)といった前後軸に沿った縦長の領域で発現する複数のprepattern遺伝子の発現によって領域分けされており、これらの協調的な働きにより、ac-scの発現が制御されると考えられていた(図1)。

第一章

　本研究において私はまずhomeobox遺伝子であるBarH1とBarH2(以下あわせてBarとよぶ)の背中の発生における役割を解析した。BarH1とBarH2は背中の最前部にあたる既知のprepattern遺伝子とは直交するような領域で発現している(図1)。Barの機能欠失型変異体ではBarの発現が失われた領域で剛毛が欠失し、この表現型はGa14/UAS系を用いたBarH1およびBarH2の強制発現によって回復した。逆にBarH1もしくはBarH2の異所的強制発現により異所的な剛毛が生じた。従ってBarH1とBarH2の機能は互いにredundantであると言える。さらにBarの機能欠失型変異および異所的強制発現によってそれぞれac-scの発現が著しく減少および異所的に誘導されたことから、Barはprepattern遺伝子として機能し、ac-scの誘導を介して剛毛の形成を正に制御すること(図2)、また背中はprepattern遺伝子の組み合わせによって前後左右方向に領域分けされていることが示された(図1)。次にBarの発現領域が分泌性蛋白であるDecapentaplegic(Dpp)とWingless(Wg)によって制御されていることを示した。dppの機能欠失型変異体ではBarが正中線側において本来の発現領域の後部で異所的に発現し、逆にdppの異所発現によってBarの発現が抑えられた。従ってdppは背中の正中線側においてBarの発現を制限していると言える。同じ結論がDppの受容体をコードするthick veins(tkv)の変異体を用いたモザイク解析によっても得られた。またwgの機能欠失型変異体ではBarの側面側での発現が失われ、逆にBarの発現領域の側面側でWgシグナルを活性化するとBarが異所的に発現した。従ってwgがBarの発現領域の側面側の境界を決めていると言える。またBarはwgの発現を抑えることにより、wgの発現領域の前側の境界を決める役割を持っていることも明らかにした(図2)。

図1 成虫背中におけるprepattern遺伝子の発現三齢幼虫後期におけるprepattern遺伝子の発現、およびそれと対応する成虫における領域を示した。どちらも左端が正中線である。○と・は剛毛の位置を示す。Barは黒、wgは灰色、pnrとiroは線で範囲を示した。図2 Barの役割のまとめBarの発現は正中線側においてはdppによって抑制され、側面側においてはwgによって活性化される。背中前端部で発現するBarはwgの発現を抑制する。さらにac-sc発現を活性化することにより剛毛の形成を正に制御する。

第二章

　Wgは様々な系でモルフォゲンとして重要な役割を果たし、背中においても他の標的遺伝子の発現制御に関わっているため、背中で領域特異的に発現する遺伝子の中でもwgの発現制御は特に重要である。さらにdppとwgの互いの発現制御、またdppとwgの協調的な働きが様々な系において報告されていたので、私は背中における両者の関係に着目し、wgの発現がdppの支配下にあることを見いだした。wgは前後軸方向に伸びたストライプ状の領域で発現するが、dppは正中線近傍のwgとは離れた領域で発現する。興味深いことにdppの機能欠失変異および強制発現のどちらによってもwgの発現は失われた。このことから中程度のDppシグナルによってwgの発現が活性化し、Dppシグナルが強すぎても弱すぎてもwgは発現しなくなると考えた。実際、Dppの受容体をコードするtkvを用いたモザイク解析によって、Dppシグナルを減衰および増強させることによりwgの発現領域が正中線側および側面側にずれることを見いだした。これは中程度のDppシグナルによって標的遺伝子の発現が活性化される初めての例である(図3)。さらにDppシグナルからwgの発現制御に至る経路について詳細に解析した結果、Dppによるwgの発現制御には4通りの経路があることを見いだした。そのうちの2つはpannier(pnr)とu-shaped(ush)を介し、あとの2つはそれらとは無関係である。PnrはGATA-1に近縁の転写因子であるが、Ushはそのco-factorでPnrと直接結合することが知られている。pnrはwgの発現領域を含んだ正中線側の領域で発現し、ushはその内側のwg領域を含まない須域で発現する。pnrの機能欠失変異では正中線側でwgが異所的に発現し、本来のwgの発現は減少した。またushの機能欠失変異では正中線側でwgが異所的に発現したが本来のwgの発現は変化しなかった。さらにpnrとushの遺伝学的相互作用から正中線側ではPnrとUshの複合体がwgの発現を抑え、本来のwgの発現領域ではUshと結合していないPnrがwgの発現を活性化していることが示された(図4)。さらにpnrの機能欠失によって正中線側の領域でwgが異所発現したことから、未知の因子Xがpnrおよびushとは独立にwgの発現を活性化していると考えられた(図4)。pnrとushの発現はどちらもDppシグナルによって正に制御されており、Dppシグナルを減衰させることにより速やかに発現が失われた。pnrとushの発現の喪失と対応してwgが正中線側で異所的に発現するが、Dppシグナルをさらに減衰させると最終的にwgの発現も完全に失われた。したがってDppシグナルはpnrおよびushを介さずにwgの発現を正に制御しており、前述のXの働きはDppに依存していると言える。またpnr/ushを介したwgの抑制にはXによるwgの活性化よりも高いレベルのDppシグナルが必要であると考えられる。さらにwgは自分自身の発現を弱く活性化することがわかった。wgの発現を制御する4通りの経路を図5にまとめた。

図3 dppによるwgの発現制御wgは中程度のDppシグナルを受け取る細胞において発現する。wgの発現領域の正中線側、側面側ではDppシグナルが過剰、もしくは不足であるためwgは発現しない。図4 pnr/ushによるwgの発現制御wgの発現領域ではUshと結合していないPnrがwg発現を活性化し、正中線側ではPnr-Ush複合体がwg発現を抑制する。さらにpnr/ushとは独立にwg発現を活性化する因子Xの存在が想定される。図5 wg発現を制御する4通りの経路Dppは正中線側ではpnrとushを誘導することによりwg発現を抑制し、その側面側ではpnrのみが誘導され、これがwg発現を活性化する。Dppはさらにpnrおよびush非依存的にwgの発現を活性化する。wgは自分自身の発現を弱く活性化する。

　本論文ではショウジョウバエの成虫背中(notum)における位置情報とパターン形成についての分子発生学的研究の結果、特にモルフォゲンとそれによる領域特異的な標的遺伝子の発現制御機構について述べられている。本論文は二章から成り、第一章はBarH1/H2ホメオボックス遺伝子の末梢神経系形成における役割及び発現制御機構に関する研究で、第二章はDecapentaplegic(Dpp)によるwingless(wg)の発現制御機構についての研究である。

　従来、背中におけるproneural遺伝子achaete-scuteの発現とそれに伴う剛毛の形成は前後軸に沿った縦長の領域で発現するprepattern遺伝子群(iroquois,pannier,wingless)の組み合わせによって制御されると考えられていた。BarH1とBarH2はBar遺伝子座に存在する互いに相同性の高いホメオボックス遺伝子であり、幼虫末梢神経系での研究等から機能的にも互いにredundantであると考えられている(以後あわせてBarと記載する)。本章においてはまず抗Bar抗体、Barエンハンサー・トラップ、Bar機能欠失株、あるいはBarによるレスキュー等により、Barが背中の前端部の横長の領域で発現し、achaete-scuteの発現を活性化することにより剛毛の形成を制御していることを示した。この発見は前後軸とは直交した横長の領域で発現するprepattern遺伝子の存在を初めて示したもので、転写制御因子の発現の組み合わせによるチェッカーボード状の場が様々な発生過程において重要な役割を果たすとの考えに対する大きな証拠となった。さらにBarの発現が正中線側および後部側においてDppモルフォゲン・シグナルによって制限され、またBarの発現の側面側の境界は別のモルフォゲンWgが決定していることを示した。更にBarが逆にwgの発現を前部側から抑制していることを示唆した。

　DppとWgは分泌性の蛋白質であり、様々な系においてモルフォゲンとして重要な役割を果たしている。さらにdppとwgの互いの発現制御が様々な系において報告されていたので、背中における両者の互いの発現制御について解析した。その結果、wgの前後軸に沿った矩形状の発現が、Dppシグナルによって正および負に制御され、中程度のDppシグナルを受ける細胞のみがwgを発現することを見いだした。これは中程度のDppシグナルによって標的遺伝子の発現が活性化される初めての例である。この系についての解析からパターン形成の一般的なメカニズムについての知見が得られると考え、Dppからwgに至る経路について解析したところ、wgの発現制御には4通りの経路があることが明らかになった。そのうち2つはpannier(pnr)とu-shaped(ush)を介し、他の2つはそれらとは無関係であった。pnrとushの発現はDppによって正に制御され、正中線側ではPnrとUshの複合体がwgの発現を抑制する。より側面側ではUshの発現は起こらず、Ushに結合していないPnr及びpnr/ush非依存的なDppの互いに独立した働きによってwgの発現が活性化された。さらにwgは自分自身の発現を弱く活性化した。このように、Dppシグナルの下流にはwgの発現を正に制御する経路と負に制御する経路が存在し、そのバランスによって最終的に中程度のDppシグナルを受ける細胞がwgを発現すると考えられる。尚、従来他の系で提案されていた、UshがPnrに結合しその活性化機能を阻害するという考えが背中でのwg発現に関しては成立せず、むしろPnr/Ush複合体が直接DNAに結合しリプレッサーとして働く可能性が大きいことを示した。更にPnr/Ush複合体は、ushの発現維持にも必要で、その場合には正の因子として働くことも見出した。

　以上のように、本研究はモルフォゲンによる位置情報、位置情報による領域特異的な遺伝子(prepattern遺伝子)の発現、さらに二次的なモルフォゲン(Wg)の発現といった、位置情報とパターン形成における基本原理をin vivoにおいて示しており、極めて重要な研究である。なお、本論文第一章は小嶋徹也、道上達男、西郷 薫、第二章は西郷 薫との共同研究であるが、いずれも論文提出者が主体となって分析及び検証を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。

　従って、博士(理学)の学位を授与できると認める。