植物は移動能力をもたないために、栄養素を根の届く範囲の限られた土壌中からしか取り入れることができない。そのため、老化し枯れ落ちていく葉の中に含まれているものさえも植物にとっては貴重な資源である。緑葉は老化の最終段階にその内容物を分解し、その構成要素である窒素やリンは発達中の器官や貯蔵器官に転流され再利用される。このとき、窒素は主にアミノ酸の形で転流されると考えられている。その中でアミドアミノ酸である、アスパラギン(Asn)とグルタミン(Gln)はいくつかの植物では導管液、篩管液中に多量に存在することや、1分子中に2原子の窒素をもつことからこれらが主な老化葉からの窒素の転流形態であると考えられてきた。AsnとGlnはそれぞれ、アスパラギン合成酵素(AS)とグルタミン合成酵素(GS1)によって合成される(図1)。実際にAsnとGlnが窒素の輸送形態として働いているとすると、緑葉では老化の進行に伴い、ASやGS1遺伝子の発現を上昇させ、それぞれの酵素タンパク質の量を増大させることによってAsnやGlnの合成速度を上げて窒素の転流を促進していると考えられる。しかし、AS及びGS1遺伝子の発現はさまざまな植物で調べられているものの、緑葉の老化過程での発現解析はあまり進んでいない。GS1遺伝子の老化葉での発現はいくつかの植物で報告されているが、人為的に老化を誘導する処理として知られる暗処理を行った場合、シロイヌナズナでは発現が上昇するという報告と、減少するという相反する報告がなされている。また、AS遺伝子は暗処理で発現が上昇することは様々な植物で確認されているが、老化葉での発現については研究例がない。

　そこで本研究では、ハツカダイコンにおいてASとGS1が共に緑葉の老化過程における窒素転流に関与しているのかどうか、もしそうでなかったらどのような生理的な役割が考えられるのか、またその遺伝子の発現はどのような機構で調節されているのか、といった点について検討した。

　これまでASとGS1はともに窒素転流に関与していると考えられてきたが、本研究により老化葉からの窒素転流におけるGS1の重要性が篩管液中のGln濃度の上昇から裏付けられた一方、ASは窒素の転流よりは,むしろアミノ酸の炭素鎖をエネルギー源として使用するために余剰となる窒素の一時的貯蔵に関与している可能性が示唆された。

　緑葉でのASとGS1の遺伝子発現の光条件への応答が葉齢により変化することから、植物は光環境が悪化すると古い葉では老化を促進して、GS1の働きにより窒素転流を加速するのに対し、若い葉ではASなどの働きにより一時的に窒素を貯蔵することにより、その葉を維持しようとしているのではないかと考えられる。これは個体内における窒素の分配を状況に応じて調節するという、高等植物が限られた窒素を有効に利用するための機構の一つであろうと推察される(図7)。

図表図1 アスハラギン合成酵素とグルタミン合成酵素の触媒する反応 / 図2 A.子葉の発達過程における葉緑素量の変化 葉緑素計(ミノルタ)にて単位面積当たりの葉緑素量を測定した,測定結果は最大値に対する相対値で示す. B.子葉の老化過程におけるAS遺伝子及びGS1遺伝子の発現量の変化播種後7、10、14、17、20、23日目のハツカダイコンの子葉から全RNAを抽出しノーザンブロット解析を行った.葉齢の進行に伴いGS1遺伝子の転写産物の蓄積量は増加するが、AS遺伝子の転写産物は検出されない. / 表1 子葉の老化過程における子葉内及び篩管液中のアミノ酸濃度の変動 / 図3 AS遺伝子とGS1遺伝子の暗所での発現 播種後7日目(A)と20日目(B)のハツカダイコンに暗処理を施したときのAS遺伝子及びGS1遺伝子の発現様式をノーザンプロット法により解析した。7日目ではAS遺伝子の、20日目ではGS1遺伝子の転写産物の蓄積量の増加を認められた。 / 図4 暗処理後の光再照射によるハツカダイコン子葉内のAS遺伝子の発現、ショ糖量、アスハラギンに含まれる窒素量、タンハク質に含まれる窒素量の変動 7日目のハツカダイコンに暗処理を施し1、3、5日目と明所に戻して1日後に子葉を刈り取り、AS遺伝子の発現、ショ糖量、アスハラギンに含まれる窒素量、タンパク質に含まれる窒素量の変動を解析した。暗所1、3、5日目の値は(●)で、明所に戻して1日後の値は(○)で示す。 / 図5 AS遺伝子とGS1遺伝子の発現に対するショ糖と光合成阻害剤であるDCMUの影響 7日目のハツカダイコンの子葉を切り葉にしてショ糖(3%)やDCMU(10m)を含む溶液に浮かべ24時間後に全RNAを抽出し、ノーザンプロット解析を行った。AS遺伝子の転写産物の蓄積量は明所でも光合成阻害剤によって増加し、また暗所ではショ糖により減少した。GS1遺伝子の転写産物の蓄積量の変化はAS遺伝子のものとは異なっていた。 / 図6 弱光下でのAS遺伝子の発現 7日目のハツカダイコンを弱光下に移し、24時間後の子葉におけるAS遺伝子の転写産物の蓄積量をノーザンプロット法により解析した。光の下でも補償点以下の弱い光の下ではAS遺伝子の転写産物の蓄積量が増加していた。 / 図7 光環境の悪化時のアスハラギン合成酵素と細胞質局在型グルタミン合成酵素の生理的役割 ASは若い葉において余剰窒素の一時的な貯蔵に、GS1は老化葉において窒素の逆流に関与していると考えられる。

　最初の章ではこれらの酵素が実際に窒素の転流に関与しているのかどうかを検証している。ハツカダイコン子葉の自然老化と暗処理による人為的な老化の過程において、ASおよびGS1遺伝子の転写産物の蓄積量とそれらの酵素の反応産物であるAsnとGlnの子葉内及び篩管液中の量的変化を解析した。その結果、GS1遺伝子の発現は若い子葉では見られないものの、齢が進むと明所においても徐々に高まり、暗処理はその発現を著しく促進し、Glnが篩管液中に増加すること、AS遺伝子は若い子葉でのみ暗条件に応答して発現し、Asnは転流されずに子葉内に留まることを示し、GS1は老化子葉からの窒素転流に極めて重要な役割を担っていること、ASは窒素の転流への関与は低いものの、暗所というストレス条件下での窒素の貯蔵に関与している可能性を示している。

　次の章では暗所におけるASの生理的役割について推察している。ハツカダイコンに長期間の暗処理を施したときの遺伝子発現の変化と子葉内の生理的変化を比較した結果は、暗所下で糖を消費しつくした子葉の細胞が、タンパク質を分解し、遊離するアミノ酸を呼吸へまわすときに発生するアンモニアをAsnに再同化する役割をASが担っていることを示唆している。また、暗処理を施した植物に光を再照射したときのAS遺伝子の発現と子葉内の生理的変化の解析結果より、暗所で合成され、転流されずに子葉細胞内に留まることを示すことによってAsnは単に解毒のためだけではなく、光再照射時に子葉内で合成されるタンパク質の窒素源として活用されていると考察している。

　最後の章では、AS遺伝子の発現に対する糖及び、窒素化合物の影響について解析し、ハツカダイコン子葉においてAS遺伝子の転写産物の蓄積は、子葉細胞内の糖濃度の低下や窒素化合物の増加により誘導されることを明らかにしている。この結果より、AS遺伝子の発現は子葉内の炭素/窒素比の低下によって誘導されるのではないかと考察している。またこの章では、自然条件下ではどのような状況においてASが働いているのかについて検討している。ハツカダイコン子葉においてAS遺伝子の転写産物の蓄積は通常の明暗周期では起こらないものの、補償点以下の弱い光条件下では24時間後に増加することから、自然条件下では天候の悪化などにより十分に光合成が行えないような状況において機能しているのではないかと述べている。

　これまでASとGS1はともに窒素転流に関与していると考えられてきたが、本研究の結果より少なくともハツカダイコンにおいては老化葉からの窒素転流におけるGS1の重要性が篩管液中のGln濃度の上昇から裏付けられた一方、ASは窒素の転流よりは、むしろアミノ酸の炭素鎖をエネルギー源として使用するために余剰となる窒素の一時的貯蔵に関与していると推察される。また、緑葉でのASとGS1の遺伝子発現の光条件への応答が葉齢により変化するのは、植物は光環境が悪化したときに古い葉では老化を促進して、GS1の働きにより窒素転流を加速するのに対し、若い葉ではASなどの働きにより一時的に窒素を貯蔵することにより、その葉を維持しようとするためではないかと考察している。以上の結果は、AS及びGS1は、それぞれ役割は異なるものの、共に植物個体内における窒素分配の最適化に寄与しており、高等植物における窒素の有効利用において重要な役割を担っていることを改めて示唆するものである。

　本論文は、渡邊昭、林浩昭、伊藤正樹との共同研究であるが、論文提出者が主体となって分析および検証を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。したがって、博士(理学)の学位を授与できると認める。