原索動物カタユウレイボヤCiona intestinalisとユウレイボヤC.savignyiの精子は海水中でほぼ運動を停止しており、未受精卵からの海水中に放出されるSAAFにより、細胞外Ca²⁺の存在下で細胞内cAMPが上昇し、運動が活性化されることが知られている(Yoshida et al.,1994)。

　Part Iでは、K⁺ionophoreであるvalinomycinがSAAFと同様に精子運動を活性化すること(図1-1)、細胞外K⁺濃度を上昇させると活性化が抑制されることを示した。これは、細胞膜のカリウム透過性が精子運動活性化に重要である事を示している。そこで、K⁺透過性を強く反映する膜電位変化を蛍光指示薬DisC₃(5)を用いて測定したところ、運動を停止している精子ではK⁺透過性が低く、SAAF添加後はK⁺透過性が急激に上昇することが明らかになった(図1-2)。静止膜電位は-50mVと算出され,SAAF添加後は大きく過分極して-100mVとなった。SAAFはvalinomycinと同様な膜の過分極を引き起こした。またK⁺蛍光指示薬により細胞内K⁺濃度がSAAF添加後減少することから精子運動活性化時に細胞内K⁺が流出すると考えられた。更に膜の過分極がK⁺チャネル阻害剤MCD-peptideで抑制されること、イオン選択性はK⁺≧Rb⁺≫Cs⁺〉Li⁺≧Na⁺であることから、SAAFはK⁺チャネルを活性化し、K⁺流出による膜の過分極を通して精子運動活性化を引き起こすことが明らかとなった。

図1.カタユウレイボヤ精子のK⁺ionophore、valinomycinによる運動開始(1-1)と膜電位変化(1-2)。(1-1)1 nM valinomycinは精子運動を活性化する。(1-2)(A)control;K⁺透過性が低いため、KClの添加により脱分極しない。(B,C);valinomycin(B)とSAAF(C)により膜の過分極及びK⁺透過性の上昇が見られる。

　カタユウレイボヤ精子では、cAMPの上昇がprotein kinaseの活性化を通してdynein軽鎖を含むいくつかのタンパク質をリン酸化し鞭毛運動を引き起こすこと、Ca²⁺の精子内への流入がcAMP濃度上昇に必要であることが私たちの研究室で明らかにされている。

　Part IIでは、Part Iの知見に基づき、膜電位変化(過分極)とcAMP合成について調べた。その結果、valinomycinは単独で精子のcAMPを上昇させた(図2)。またこの反応は細胞外Ca²⁺に依存しないことが明らかになった。次に2mM IBMX処理した精子にSAAFとvalinomycinを加えたところ、2mM IBMXのみでcAMP濃度を上昇させ精子の運動を引き起こすこと、更なるSAAFまたはvalinomycinの添加はcAMP濃度を更に上昇させることが明らかになった。この結果は、運動を停止している精子ではphosphodiesterase活性が高いためcAMP濃度が低いこと、膜の過分極はadenylyl cyclase活性を上昇させcAMP濃度を上昇させることを示唆している。K⁺チャネル阻害剤MCD-peptideはSAAFによるcAMP上昇を抑えるが、valinomycinによるcAMP上昇は阻害せず、この考えを支持している。

図2.膜の過分極によるcAMP濃度の上昇。(A)SAAF(●)、valinomycin(▲)によりcAMPが上昇するが、両物質を含まないControl(○)では上昇しない。(B)cAMP濃度は200M IBMX(□)では上昇しないが2mM IBMX(■)により上昇する。2mM IBMX処理した精子にSAAF(●)またはvalinomycin(▲)を作用させると、更にcAMP濃度が上昇する。

　細胞内Ca²⁺濃度上昇と運動活性化との関係についてCa²⁺イオノフォアionomycinを用いて調べたところ、細胞外Ca²⁺と200M IBMXの存在下でionomycin処理をすると精子運動が活性化された。IBMX非存在下では運動活性化率が低いことから、細胞内Ca²⁺によるadenylyl cyclase活性化作用は弱いことが予想される。

　以上より、カタユウレイボヤ・ユウレイボヤ精子ではSAAFの作用で細胞膜が過分極しそれがadenylyl cyclaseを直接活性化しcAMP濃度を上昇させ,精子を活性化することが明らかになった。またCa²⁺はこの酵素の活性化には直接関与しないと考えられる。

　カタユウレイボヤ・ユウレイボヤ精子では頭部とミトコンドリアとの間に細胞内ベシクルが存在し、Ca²⁺ストアとして細胞質のCa²⁺濃度を上昇させミトコンドリアの変形及び鞭毛に沿った滑り運動を引き起こすこと(sperm reaction)が報告されている。

　Part IIIでは精子鞭毛運動について研究を進めるにあたり、精子膜を窒素キャビテーション法で単離し精子膜ベシクルを作成し、細胞内ストアの関与しない系で鞭毛運動に関与するion channelの解析を行った。まず精子膜ベシクルを用いてその膜電位変化を蛍光指示薬DisC₃(5)で測定した。次に膜ベシクルを人工脂質二重膜に融合させ個々のion channel活動を電気生理学的に解析した。前者では、ベシクル内液のK⁺濃度を外液の40倍高くし、SAAFを作用させたところベシクル膜のK⁺透過性が上昇し膜を過分極すること、鞭毛より単離した膜ベシクルはSAAFに反応するが頭部由来の膜ベシクルは反応しないことが明らかとなった(図3)。また外液のCa²⁺はSAAFにょるK⁺透過性上昇を増大させるが、ベシクル内のCa²⁺濃度をionomycinで上昇させてもK⁺透過性上昇は見られなかった。以上の結果よりSAAF依存性のK⁺チャネルは精子鞭毛に局在すること、細胞外Ca²⁺はSAAFによるK⁺チャネルの活性化を増大させることが示唆された。後者ではSAAFの非存在下で活動する陽イオン選択性のion channelが観察された。また人工脂質二重膜に融合した精子ion channelの幾つかが、SAAFにより活性化されることも明かとなった。

図3.精子膜ベシクルの膜電位変化。(A)頭部精子膜ベシクルは外液へのSAAF、CaCl₂(5mM)、KCl(+1,2,4mM)の添加に反応しない。(B)鞭毛精子膜ベシクルはSAAFとCaCl₂の存在下でK⁺透過性を上昇させ、膜を過分極させる。K⁺透過性が上昇しているため、KClを添加すると脱分極する。実験開始時のK⁺濃度はベシクル内液40mM、外液1mM。