グラッシースタント病葉抽出液より分画遠心法とショ糖密度勾配遠心法により、RGSV核酸タンパク性粒子を含む精製液を得、常法により核酸を抽出し、ランダムプテイマーを用いてcDNAライブラリーを作製した。任意に118クローン(平均インサート長1.5kb)を選び、インサートの両端から600-700塩基の配列を決定し、ソフトウエア的にアッセンブリした。ゲノムの5’および3’末端配列及びcDNAクローンの得られなかった内部領域は、相同性の高い塩基配列や他の分離株で報告されている塩基配列に基づいてプライマーを設計し、RT-PCR法により増幅後、塩基配列を決定した。その結果、6種のRNA断片からなるRGSVの全ゲノムは25159塩基からなり、RNA1は9760塩基で機能不明の19kDaタンパクと339kDaのウイルスRNA複製酵素タンパクを、RNA2は4069塩基で23kDaの推定細胞間移行タンパクと94kDaの推定膜糖タンパクを、RNA3は3127塩基で機能不明の22kDaと31kDaの2種類のタンパクを、RNA4は2915塩基で機能不明の19kDaと60kDaの2種類のタンパクを、RNA5は2074塩基で機能不明の22kDaタンパクと36kDaのキャプシドタンパクを、RNA6は2590塩基で21kDaの封入体タンパクと機能不明の36kDaタンパクをそれぞれコードすることが明らかとなった。

　本研究に先んじて全塩基配列の解明されたフィリピン北部ルソン島分離株(ラグナ株)(Toriyama,1997;1998)と塩基レベルでの違いを調べたところ、各断片毎に変異率の違いが顕著に認められた。すなわち、RNA1.RNA4およびRNA5は2分離株間で殆ど同一であったのに対し、RNA2、RNA3およびRNA6では、6.9%から11.6%の違いが認められた。2分離株の採集地は1000km程隔たっているが、共に1980年代後半に採集されたものである。この結果は、RGSVゲノムを構成する6種のRNA断片が自然界でリアソートメントを起こしたことを示唆している。分節ゲノムウイルスのリアソートメントはオルソミクソウイルス、レオウイルス、ブニヤウイルスなど、動物ウイルスでは一般的に知られた現象であるが、植物ウイルスでの自然界での発生を塩基レベルで明らかにしたのは本研究が初めてである。リアソートメントの出現が感染イネ体内か媒介トビイロウンカ体内かは明らかではないが、異なる病原性変異株出現の一因になっているものと考えられた。

　上述したランダムcDNAライブラリーを解析する過程で、RGSVゲノムとは無関係の3729塩基からなるプラス鎖RNAウイルス様ゲノムが検出された。本RNAは5’末端から37kDaタンパク、54kDaタンパク、15kDaタンパクおよび28kDaタンパクをコードする4つのORFを持っていた。37kDaタンパクORFの終始コドン周辺には、-1フレームシフトに特有の塩基配列と推定2次構造があり、-1フレームシフトにより下流の54kDaタンパクを含む96kDaタンパクが発現される可能性が示された。推定フレームシフト部位下流領域は、双子葉草本および果樹類に感染するダイアンソウイルスのRNAポリメレース領域とアミノ酸レベルで60%一致していた。一方、3’末端側の28kDaタンパクはN末端側が塩基性アミノ酸に富み、多くの小球形ウイルスの外被タンパクに共通する特徴を示していた。28kDaタンパクのC末端21kDa領域をGST融合タンパクとして大腸菌内で発現させ、抗原としてウサギで抗血清を作製した。この抗血清を用いたウエスタンブロット解析により、グラッシースタント病葉より特異的に28kDaタンパクが検出された。また、ショ糖密度勾配遠心後の各フラクションからは、28kDaタンパクは本RNAゲノムと同一の分画から検出され、核酸タンパク性構造を持つことが示された。しかしながら、電子顕微鏡観察では、ダイアンソウイルス様の小球形粒子は検出されなかった。15kDaタンパクとアミノ酸レベルで相同性のあるタンパクはデータベース上になく、機能タンパクとして発現されるかどうかは不明である。

　本RNAゲノムは2分節ゲノム性ダイアンソウイルスのRNA1に遺伝子構造およびコードされたタンパクのアミノ酸配列が類似しているため、イネウイルスX(rice virusX、RVX)と仮称した。RVXが単独でイネに感染するか、RNA2が存在するか、グラッシースタント病との関連は何か、トビイロウンカで単独伝搬されるのか等、今後の研究課題と考えられる。

　同じランダムcDNAライブラリーから、イネツングロ球形ウイルスのcDNAが2クローンから検出された。ツングロ球形ウイルスはツングロ桿状ウイルストと共に、ヨコバイ類によって伝搬され、トビイロウンカでは伝搬されないため、感染の由来は明らかではない。しかし、RGSVとの混合感染がグラッシースタント病の病原性の差違の一要因になっている可能性が考えられた。

　さらに異なるcDNAライブラリーから、gypsy様とcopia様の2種類のレトロトランスポゾンと翻訳アミノ酸配列の相同性の高い塩基配列が検出された。これらのレトロトランスポゾンがRGSV感染によって誘発されたものかどうかは明らかではないが、宿主遺伝子の組み換えや破壊をもたらし、病徴発現への関与も考えられた。

　以上を要するに、本研究では、イネグラッシースタント病・病原ウイルスRGSVの遺伝子構造を明らかにする目的で、罹病葉から抽出したRGSV分画由来のcDNAライブラリーを作製し、塩基配列を解析した。その結果、RGSVのみならず、新種のイネウイルスと推定されるRNAゲノム、およびイネツングロ球形ウイルスが検出され、さらに宿主のレトロトランスポゾンの活性化が示唆された。また、RGSVゲノムの自然界でのリアソートメント現象が実証された。これらが総合的にイネグラッシースタント病の病原性の差違の原因になるものと推察される。これらの研究成果は、さらなる病原性解析および今後の抵抗性イネ作出における基盤的知見となるものと考える。