高等植物の篩管は、各種栄養成分の長距離輸送を担う器官として古くから知られ、しばしば高等動物の血管に例えられてきた。近年では、篩管液中に様々なタンパク質、RNAなどが発見されており、栄養成分のみならず情報の伝達に関しても重要な役割を担っていると考えられている。また、篩管は篩部要素と呼ばれる核を失った細胞の連なりによって構成されているため、篩管内のタンパク質やRNAは隣接する伴細胞から原形質連絡を通って篩部要素に供給されるものと考えられており、この篩部要素-伴細胞複合体は原形質連絡を介した細胞間の物質移行の面から見ても興味深い研究対象となっている。これらの観点から篩管を研究する際、例えば、篩管内に発見された特定のRNAがどのような機能や活性を持つかというアッセイ、あるいは伴細胞-篩部要素間の原形質連絡を通過可能な物質の分子量限界の測定といった研究を進める上で、植物体の外部から望みの物質を篩管に導入する技術が強く求められる。しかし、タンパク質や核酸といった高分子物質を外部から篩管に導入しようとする場合、細胞膜を通過できる一部の低分子物質の場合と異なり葉面散布などの間接的な方法は用いることができない。直接的に篩管に物質を注入する方法があれば、高等動物や人間の血管に薬剤を注射するのと同様に、篩管の研究にとって大きな助けとなるはずである。

　近年、微細なガラス針を細胞に挿入するマイクロインジェクション法を用いて高等植物の篩管に物質を注入した例がいくつか報告されている。ただし、高等植物の篩管は非常に細く(イネの場合で直径およそ10m以下)、また表皮以下何層もの厚く堅い細胞壁を持つ細胞の下に存在しているために、生きた植物体の篩管に対してマイクロインジェクションを直接行なうことは極めて難しい。そのためこれらの報告例のほとんどは、篩部を含む組織片を植物体から切り出して緩衝液中に置き、組織中の篩管に対して顕微鏡下でガラス針を挿入するという技法を用いている。これは正確に篩管にガラス針を挿入するには相当の熟練を要する上、植物組織に与えるダメージが非常に大きいと思われる。

　当研究室では以前より、イネの篩管液を吸汁する害虫であるトビイロウンカ(Nilaparvata lugens STÅL)が篩管に挿入した口針をYAGレーザービームで切断するという手法により、イネから純粋な篩管液を採取し、その分析を行ってきた。本研究ではその手法を逆向きに応用し、生きたイネ植物体の篩管内へ切断した口針を通して物質を直接注入する新たな方法を考案、開発し、The method of micro-introduction using stylet of insects(MUSI法)と命名した。

　高等植物の篩管は、各種栄養成分の長距離輸送を担う器官であり、しばしば高等動物の血管に例えられてきた。近年では、篩管液中から様々なタンパク質、RNAなどが発見され、栄養成分のみならず情報の伝達に関しても重要な役割を担っていると考えられている。篩管内のタンパク質やRNAは、隣接する伴細胞から原形質連絡を通って篩部要素に供給されるものと考えられており、この篩部要素-伴細胞複合体は原形質連絡を介した細胞間の物質移行の面から見ても興味深い研究対象となっている。これらの観点から篩管を研究する際、植物体の外部から望みの物質を篩管に直接導入する技術が強く求められている。そのような技術として、微細なガラス針を細胞に挿入するマイクロインジェクション法が注目されているが、この方法は技術的に熟練を要するうえ、篩部を含む組織片を用いたものが多く、完全な植物体の篩管に対して物質を直接注入するものではない。著者は、直接注入する方法として、イネの篩管液を吸汁するトビイロウンカを用いた篩管液の採取法に着目した。本論文は、トビイロウンカが篩管に挿入した口針をレーザービームで切断し、この口針を通して篩管内へ物質を直接注入する新たな方法を考案、開発して報告したものである。論文はThe method of micro-introduction using stylet of insect(MUSI法)と命名した方法と、これを応用したいくつかの研究実例を併せて報告しており、4章から成る。

　第一章では研究の背景や意義について述べている。第二章では実際に蛍光色素をイネの篩管へ注入した例を示してMUSI法について説明している。イネの篩管への蛍光色素の注入は、イネの葉鞘から吸汁しているトビイロウンカの口針を切断し、切断面から溢泌した篩管液滴に、蛍光色素溶液を添加して行った。数時間後に蛍光顕微鏡を用いて葉鞘を表面から観察、また横断切片を作製して維管束を観察した。その結果、口針挿入部位から葉身・基部両方向に数百mにわたって色素の蛍光が維管束内部に検出され、その横断切片において一個の篩部要素のみに蛍光色素が検出された。これにより、MUSI法を用いて完全なイネ植物体の篩管内へ物質を直接注入できることが示された。

　第三章では、開発したMUSI法が、篩管-伴細胞間の物質移行の研究と、篩管内RNAの機能解明に向けた研究に有効な手法であることを示すべく、3つの実験を行っている。一つ目は、MUSI法により篩管に注入した物質の存在分布が物質の分子量の違いに依存して異なることを示した実験である。蛍光波長と分子量の異なる二種類の蛍光色素、FITC-dextran(分子量約42kD)とTMR-dextran(分子量約3kD)の混合溶液をMUSI法によりイネ葉鞘の篩管に注入した。横断切片を観察したところ、FITCは一つの篩部要素に限られて検出されたが、TMRはその篩部要素を含む篩部領域全体に拡がって検出された。この結果から篩部要素-伴細胞間の原形質連絡の分子量限界が3kDがら42kDの間にあると推定している。二つ目の実験は、放射性標識をしたRNAやUTPをMUSI法によりイネ葉鞘にアプライした後、それらの標識物質がどのように植物体中を長距離移行するかをオートラジオグラフィーにより示したものである。オートラジオグラフを比較することにより、篩管を通した植物体全身への転流や、篩管から周囲の組織への転流物質の積み下ろしの性質について考察している。三つ目の実験は、RNAが篩管内で翻訳されうるのではないかという、海外の研究グループによって近年提示された仮説の検証を目的として行われたものである。Green Fluorescent Protein(GFP)のRNAをイネ葉鞘にMUSI法でアプライした後、アプライ部を含む周囲の組織からタンパク質を抽出し,抗GFPモノクローナル抗体を用いてwestern blot analysisを行ったところ、抗体に反応するタンパク質のバンドが検出された。このことから、まだ様々な可能性について検討しなければならないものの、当該仮説に対して肯定的なデータが得られている。

　第四章では、総合的な考察とこの新手法の応用性など今後の展望が述べられている。

　以上、本論文は、完全なイネ植物体の篩管内へ物質を直接注入する新たな方法が開発できたことを報告するとともに、篩管の研究においてこれまで技術的に困難であった分野に対してこの方法が有効であることをいくつかの応用実例によって示したものであり、学術上、応用上、貢献するところが少なくない。よって審査委員一同は、本論文が博士〔農学〕の学位論文として価値あるものと認めた。