本解析に用いた変異株は、30℃では正常に増殖し桿菌となるが、42℃では細胞分裂が阻害されて多核フィラメントとなる「広田の温度感受性変異体バンク」430系統の中から選別した。DNA複製や分配には影響を与えず、分裂装置の形成にのみ欠損を持つ変異株として、42℃で培養すると、DNAがきれいに分配されたフィラメント細胞となる変異株fts715を選別した。fts715変異株の高温感受性を相補するプラスミド、pLC20-46から、fts715変異を相補するDNA領域のサブクローニングを行ったところ、大腸菌染色体上57.3分に存在するhscA遺伝子が相補活性を持つことが解った。また、P1マッピングにより、fts715変異は57.5分領域に存在するZff::Tn10と96%の確率で共形質導入されることが解った。fts715変異株のゲノムからクローニングしたhscA遺伝子(＝hscA715遺伝子)の塩基配列を解析した結果、575番目のCがGに変異していた。これにより、HscA蛋白質の192番目のアラニンがバリンに変異していると思われる。この変異型hscA715遺伝子を担うプラスミドはfts715変異株を相補できなかった。以上の事実からfts715変異株はhscA遺伝子の変異株であることが示唆された。

　fts715変異株の変異形質がhscA遺伝子の変異によるのかどうかを確認するためにhscA遺伝子の破壊株を作成し解析を行った。その結果、fts715変異株のhscA遺伝子を破壊した株は30℃、42℃共に生育し、桿菌形態を示した。即ち、hscA遺伝子は細胞分裂に必須ではなかった。しかし、この欠損株を変異型hscA715遺伝子を担うプラスミドで形質転換した株はfts715変異形質を示した。即ち、30℃では桿菌、42℃では伸長した細胞を形成し、増殖は温度感受性であった。対照実験として、上記破壊株を野生型hscA遺伝子で形質転換した株は30℃、42℃共に桿菌形態で、高温でも生育できた。このことから、以下の2つの可能性を推論した。1つは野生型HscAは細胞分裂には全く関与せず、変異型HscA715がアリール特異的に分裂を阻害する可能性である。2つ目は、野生型HscAは分裂に関与するが、他に代用できる蛋白質が存在するために、破壊株を作製しても分裂に影響を示さず、たまたまfts715変異株では両蛋白質に変異が生じたために分裂が阻害された可能性である。

　両可能性を検討するため、次に野生株のhscA遺伝子を破壊した株を同様に作成し解析を行った結果、30℃、42℃共に生育し、桿菌形態を示した。しかも、この破壊株を変異型hscA715遺伝子をもつプラスミドで形質転換した株は、温度感受性にならず、30℃、42℃共に桿菌形態であった。この結果はfts715変異株のhscA遺伝子を破壊した結果と異なっており、変異型hscA715遺伝子が細胞分裂を阻害するためにはfts715変異株の遺伝的背景が必要であることが解った。つまり、第2の可能性が示唆された。HscAはHsp70ファミリーの蛋白質であり、大腸菌では、DnaK、Hsc62と高い相同性を持ち、in vitroにおいてATPase活性があり、シャペロンとして機能することが知られている。従って、DnaKやHsc62などが、HscAの代用をしている可能性も考えられる。hscA遺伝子については、既にT.H.KawulaらによりhscA1変異が分離されている。この変異はhns(大腸菌のヒストン様蛋白質をコードする遺伝子)の変異形質を部分的に抑制することが知られているが、分裂との関わりについては全く解析されていない。また、HscAはバクテリアに広く保存されおり、大腸菌の全蛋白質量の約1%も存在するにもかかわらず、その細胞内機能については良く解っていない。

　そこで、hscA遺伝子の変異fts715が、分裂装置構築のどの過程に影響を与えているか解析を行った。まず、fts715変異が、FtsZリング形成の前後どちらの過程に影響を与えているか解析するために、FtsZの細胞内局在を間接蛍光抗体法で観察した。その結果、30℃では野生株と同様、桿菌細胞の中央部に顕著なFtsZリングが観察された。しかし、42℃では分裂予定位置にFtsZリングがほとんど検出されず、しかも検出されたFtsZリングは全てフィラメント細胞の端側の分裂予定面に位置していた。恐らく、30℃で形成されたFtsZリングが培養温度を42℃に切り替えたことにより途中で停止したものと思われる。このような形質はFtsZ蛋白質の量が減少したことが原因とも考えられたので、FtsZ量をウエスタンブロッティングにより測定した結果、fts715変異株と野生株ではFtsZ量に違いは無かった。以上の結果から、fts715変異は、細胞質中のFtsZが集合してFtsZリングを形成する過程を阻害していることが解った。

　野生型HscAの機能を類推するために、アラビノースプロモーターによりhscA遺伝子の発現を制御した株について、FtsZリングの局在を解析した。その結果、hscA遺伝子の発現が抑制された条件下では、63%の細胞においてFtsZリングは分裂予定面に観察されたが、細胞の端のポールにのみFtsZリングが観察された細胞が15%存在した。また、ポール側にのみFtsZリングをもつ細胞は、比較的小さい細胞であることから、分裂した直後の細胞と思われる。hscA遺伝子を発現させた細胞では、90%以上の細胞でFtsZリングが分裂予定面にのみ観察された。以上の結果からHscAはFtsZリングの形成に関与していて、HscAが欠乏するとFtsZリングが異常になり、分裂後FtsZが速やかに脱リングしない、あるいはHscAはFtsZの脱リングに直接関与している可能性が示唆された。

　まず、野生型HscA蛋白質を精製し抗体を作成した。この抗体はHscAだけでなくDnaKも認識したので、野生株のdnaKを破壊した株について、HscAの細胞内局在を観察した。その結果、分裂直後の小さい細胞では両端のポール側にHscAが局在するが、少し成長した細胞では分裂予定面と両ポールの合計3ケ所にHscAが局在していた。この結果は前項4のFtsZの局在から得た推論を強く支持するものである。以上の2つの結果から、HscAとFtsZの間に物理的相互作用があることが強く示唆された。