真正細菌のRNAポリメラーゼのシグマサブユニットは、酵素活性を持つコア酵素(E)に結合し、ホロ酵素(E)を形成することでプロモーター認識能と転写開始能を付与する因子である。細胞は複数のシグマ因子を持ち、それらのシグマ因子を置換することによって、転写装置のプロモーター認識特異性を変換して生理状態に対応した遺伝子群を転写する。大腸菌には七種類のシグマ因子があるが、その中の六種類は⁷⁰ファミリーのグループに属する。⁷⁰ファミリーのシグマ因子には、アミノ酸配列の解析から四つの保存領域(region1-4)が見い出されている。それぞれの保存領域はさらにサブリージョンに分けられる(region1.1、1.2、2.1、2.2、2.3、2.4、3.1、3.2、4.1、4.2)。これらの領域は、突然変異体を用いた解析などにより一部その機能が明らかになってきている。Region1.1はホロ酵素を形成していない状態でのシグマ因子のDNAへの結合を阻害する。Region2.1は、コア酵素の結合に必須な領域である。E⁷⁰によって認識されるプロモーターは多くが転写開始点から上流10bpおよび35bp周辺に存在する二組のヘキサマー配列(-10領域、-35領域)から構成されるが、Region2.4が-10領域を、region4.2が-35領域をそれぞれ認識する。

　大腸菌のrpoS遺伝子は、増殖定常期、高浸透圧により誘導される多くの遺伝子の発現制御を行うことにより、様々なストレスに対する耐性獲得の過程で中心的に働いていることが知られている。rpoS遺伝子産物である³⁸は、主要シグマ因子⁷⁰と高い相同性があり、in vitroの実験から³⁸依存型プロモーターだけでなく、⁷⁰のコンセンサス型プロモーターの一部を認識することが知られている。従って、³⁸は定常期における³⁸依存型遺伝子の転写制御だけでなく⁷⁰依存型遺伝子の転写制御にも関わっていると考えられる。一方、³⁸と⁷⁰は相同性が高いことや両者に共通するプロモーターが存在することなどから、機能的に似ていることが予想されるが、何れか一方のシグマ因子によってのみ認識されるプロモーターが存在することから、二つのシグマ因子のプロモーター認識特異性には明確な違いがある。このように、³⁸の機能領域を明らかにすることは、定常期における転写制御を理解するために不可欠である。また、rpoS遺伝子は増殖に必須ではないことから、変異体の取得や解析が容易に行えるという利点を持つ。従って、³⁸を用いての機能解析によって、基本的な転写開始機構に関する理解が深まると考えられる。本研究では、増殖定常期における転写制御機構を理解するために、³⁸の機能領域の解析を行った。

1³⁸に特異的な機能領域の同定と機能解析

　まずはじめに、³⁸固有の機能領域を同定することを試みた。様々な腸内細菌において同定されているrpoS相同遺伝子のアミノ酸配列を比較した結果、rpoS相同遺伝子間で保存性が高く、rpoD遺伝子とは保存性の低い領域をregion4よりもC末端側に認め、CTE(Carboxy-terminal-Tail-Element)と名付けた。⁷⁰のCTEに相当する領域は、転写因子と相互作用する領域であるが、³⁸においては未だ機能が見いだされていない。このことから、CTEが³⁸に特有な機能を持つ領域ではないかと考え、CTEの機能解析を行った。

1.1³⁸のC末端領域16アミノ酸の欠失による細胞内における転写活性への影響

　³⁸のCTE(³⁸-CTE)の機能を調べるため、CTEを欠失した³⁸(^38(1-314))および野生型³⁸の発現系を構築し、³⁸依存型のkatEプロモーターの転写活性を指標として細胞内における³⁸活性を測定した。その結果、CTEの欠失により、katEプロモーターの転写活性が消失した。この系では³⁸、^38(1-314)を対数増殖期に強制的に発現させており、実際の定常期の転写活性を反映しているかどうかはわからなかった。そこで低コピープラスミドにrpoSオペロン全体を挿入して、³⁸および^38(1-314)がより染色体上のrpoS遺伝子の発現に近い状態で発現する系を構築した。また、この現象がプロモーター特異的な現象かどうかを検証するため、様々な³⁸依存型プロモーター(katE、bolA、fic、orfI、wrbAプロモーター)の転写活性を測定した。その結果、解析したすべてのプロモーターで、CTEの欠失により転写活性が消失し、これらのプロモーターにおいても、³⁸による転写にはCTEが必須であることが示された。次にin vitroにおいて³⁸が認識することが示されているlacプロモーターについて細胞内の³⁸による転写活性への影響と、CTEの影響を解析した。定常期において、³⁸はlacプロモーターの転写活性を抑制したが、CTEの欠失により、この抑制もみられなくなった。これらの結果から、³⁸のCTEは、転写因子への応答にではなく、基本的な³⁸のシグマ因子活性に影響を及ぼしていると考えられた。また、³⁸は細胞内でもlacプロモーターを認識しており、その転写を負に制御していることが示唆された。

1.2³⁸の転写活性に重要なCTEのアミノ酸残基の解析

　³⁸-CTEがE³⁸による転写に重要であることが示された。そこで³⁸-CTEの16アミノ酸のうち、どのアミノ酸残基がシグマ因子活性に重要であるかを調べるため、CTEの16アミノ酸をそれぞれアラニンに置換した変異体³⁸を用いて細胞内での転写活性を測定した。その結果、317番目のLeu、323番目のAsn、327番目のLeu周辺が特に重要であることが示された。これらのアミノ酸はCTEの中でもよく保存されている。

2³⁸-CTEの転写開始反応における役割2.1³⁸-CTEの欠失によるホロ酵素形成への影響

　CTE欠失によって³⁸のシグマ因子活性がどの様に影響を受けているかを解析するために、精製したコア酵素、^38(1-314)、および³⁸を用いてin vitro転写アッセイを行った。その結果、CTEの欠失によってlacUV5、ficプロモーターの転写活性が低下したが、シグマ因子を過剰に加えることによって転写活性が一部回復した。従って、転写反応の最初の段階であるホロ酵素の形成が、CTEの欠失によって影響を受けていることが考えられた。そこでin vitroにおけるホロ酵素形成率を測定した。ホロ酵素の形成率はCTEの欠失により著しく低下し、CTEが³⁸のホロ酵素の形成に重要であることが示唆された。この結果がCTEを欠失したことによる細胞内の転写活性の消失を反映しているかどうかをみるために、細胞内でのホロ酵素形成率を評価することを試みた。³⁸または^38(1-314)の発現プラスミドを保有する株の増殖定常期のcrude cell lysateに対してゲル濾過クロマトグラフィーを行い、ウエスタン解析により、ホロ酵素およびフリーのシグマ因子のフラクションに存在する³⁸または^38(1-314)のバンドを定量した。その結果、細胞内においてもCTEの欠失によりホロ酵素形成率が低下することが示唆された。

2.2³⁸のホロ酵素形成におけるCTEの役割

　コア酵素との結合に必須なシグマ因子の領域はregion2.1であるが、region2.2、2.4、3および4も、コア酵素との結合に関わっていることが示されている。本研究において見い出された³⁸のCTEは、ホロ酵素の形成に関わっていることが示唆されたのでCTEがどのようにホロ酵素形成に寄与しているかを解析した。シグマ因子のregion1.1は、ホロ酵素を形成していないシグマ因子がDNAに結合することを阻害する領域である。⁷⁰において、region4を含むC末端領域がregion1.1と相互作用してDNAの結合を阻害していることが明らかになっている。このことから、³⁸ではCTEがN末端と相互作用をしている可能性が考えられた。そこで³⁸のN末端領域部分タンパクとCTE-GST融合タンパク質を精製し、GST pull down assayにより、これらの相互作用の有無を現在解析中である。

　ゲノムから遺伝情報を取り出す転写は遺伝子発現制御の最も重要な段階である。真正細菌のRNAポリメラーゼは、コア酵素とこれにプロモータ選択能及び転写開始能を付与するシグマ()因子とからなる。本研究は、大腸菌の定常期・浸透圧特異的なシグマ因子、³⁸に特異的な機能領域を解析した結果をまとめたものであり、4章よりなる。

　序章で大腸菌を中心として得られている真正細菌のRNAポリメラーゼ、シグマ因子、プロモータ等についてのこれまでの知見を総括した後、第1章では、大腸菌で比較的最近発見された定常期並びに浸透圧応答性の主要型シグマ因子,³⁸(rpoS遺伝子産物)の特異的な機能領域を検索した結果について述べている。³⁸蛋白質は主要因子⁷⁰と共通する基本骨格構造を持つが、領域4.2よりC-末端に至る領域(CTE:C-terminal element)は両者の間では相同性が低い。ところが、さまざまな真正細菌のrpoS相同遺伝子産物間では保存性が高いことから、それぞれ特有の機能を持つことが示唆された。このことを検証するため、野生型³⁸とCTE欠失型^38(1-314)による細胞内転写活性への影響をkatE、lac及びlacUV5プロモーターを用いて調べた。その結果、^38(1-314)は、in vitroで転写開始活性を保持しているにも拘わらず、in vivoでkatE、fic、wrbAなどの³⁸特異的なプロモーターの転写を行なうことができないことが分かった。一方、³⁸は定常期における遺伝子発現の正の制御因子であると同時に⁷⁰依存型プロモーターからの転写開始を抑制する働きを持つ(負の制御)ことが知られている。実際、rpoS欠損株ではいくつかの遺伝子発現の定常期における抑制が解除される。そこで、この負の制御に³⁸-CTEが関与しているかどうかについて⁷⁰と³⁸の両方によって認識されるlacプロモーターを用いて調べた。その結果、^38(1-314)を持つ株では、lacプロモーターからの定常期における転写抑制が解除されていることが示された。これらの結果は、³⁸のCTE領域がin vivoにおける³⁸による正と負の制御に関与していることを示唆している。更に、16アミノ酸からなるCTE領域のどのアミノ酸がこれらの機能に関与しているかをアラニンスキャンニング法により解析した。その結果、317番目のロイシン、323番目のアスパラギン、327番目のロイシンの比較的良く保存された3つのアミノ酸が重要であることが明らかになった。

　第2章では、³⁸のCTE領域が³⁸とコア酵素との結合能に影響している可能性について検討を行った結果を述べている。それぞれ精製したコア酵素と野生型並びにCTE欠失型の³⁸蛋白質とを1:1,1:4,1:16の量比で混合し、形成されるホロ酵素と転写能を解析した。その結果、CTE欠失³⁸の量比を増やすと転写活性能が回復することが明らかになった。CTEがホロ酵素の安定性に寄与をしていることを示唆している。

　第3章は、³⁸のCTE領域の有無とin vitroにおける転写の塩濃度感受性について解析した結果を述べている。野生型のE³⁸ではK-glutamate(あるいはNa-glutamate)濃度が100-200mMと上昇するにしたがってficプロモーターからの転写が促進されるのに対し、E^38(1-314)では50mM K-glutamateが最適濃度で、200mMでは転写が著しく阻害された。尚、それぞれの条件で形成されるホロ酵素の量には顕著な差異は認められなかった。これらの結果は³⁸のCTE領域が細胞内の塩濃度に対応した活性制御に関わっていることを示唆しており、定常期細胞では細胞内塩濃度が100-500mMであるとする知見と一致する。

　第4章は総合討論である。

　以上要するに本論文は、大腸菌の定常期特異的シグマ因子³⁸固有の機能を持つCTE領域を見い出し、この領域が塩濃度感受性と主要シグマ因子⁷⁰に対する負の制御に関わっていることを見い出したものであり、学術上、応用上寄与するとことが少なくない。よって審査委員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。