-セクレターゼについて

　当研究室では以前よりAPPの分泌・代謝機構について研究をすすめており、-セクレターゼについても、切断部位周辺のアミノ酸配列をモチーフとしたペプチド基質(KM基質、正常APP由来:MOCAc-SEVKMDAEFR-K(RR-NH₂)-DNPとNL基質、Swedish型APP由来:MOCAc-SEVNLDAEFR-K(RR-NH₂)-DNP)を用いてウシ脳から精製が行われてきた。その結果、一つの候補が同定され、このタンパク質のN末端アミノ酸配列を決定したところ、thimet oligopeptidase(TOP:EC 3.4.24.15,thimet:thiol-,metallo-dependent)と呼ばれるSH依存性のメタロプロテアーゼであることが判明した。TOPはこれまでにも-セクレターゼの候補として報告されていたことから、実際に-セクレターゼとしての性質を持つかどうかを検討することとした。

　結果:まずTOPの性質を調べるに当たって、COS細胞(アフリカミドリザル腎由来線維芽細胞)や大腸菌等での発現、そしてヒトのTOPの性質を検討すべく遺伝子の単離を行った。方法はPCRによるクローニングであり、ライブラリーとしてはhuman brain cDNA libraryを用いた。まず、N末端からメタロプロテアーゼとしての活性中心を含まない、372アミノ酸残基の部分タンパク質を大腸菌で発現させ、これを抗原としてウサギ(New Zealand White種)に注射して抗TOP抗体を作成した。作成した抗体はCOS細胞で発現させたヒトTOPを認識するとともに、内在性のTOPも検出することが出来た。また、COS細胞で発現するに当たって、ヒトTOPの精製を試みることも考慮し、C末端にHis-tagを導入するとともに、その直前にMyc-tagを導入することとした。COS細胞で発現したヒトTOPについて先ほどのKM、NL基質でその活性を検討したところ、KM、NL基質に特異的にその切断活性が見られた。またその切断活性については2価金属イオンとSH試薬に依存的であった。

　次に、COS細胞に発現したヒトTOPのさらなる解析を行うために、C末端に導入したHis-tagを利用し、ヒトTOPを一過性に導入したCOS細胞15cmディッシュ25枚分より精製を行った。精製したヒトTOPについてKM、NL基質とともに、その他いくつかの人工基質(プロテアソーム、カルパイン、プロリルオリゴペプチダーゼなど)を用いて活性を測定したところ、精製したヒトTOPは-セクレターゼ切断部位をモチーフとしたKM、NL基質のみで活性が認められた。さらに、この二つの基質の切断活性を指標として種々の阻害剤の影響を検討した結果、メタロプロテアーゼ阻害剤でのみ阻害活性が見られた。以上のことからCOS細胞に発現したヒトTOPは-セクレターゼとして非常に有力な候補の一つと考えられる結果となった。

　最後にヒトTOPをAPP695とCOS細胞に共発現させ、培地中に分泌されるAPPのN末端分泌産物(sAPP:secreted form of APP)について検討した。その結果、APP695はヒトTOPと共発現したときに、APP単独時に比べsAPPの分泌量が1.3倍程度の増加が見られた。このときCOS細胞では通常優位に見られる-セクレターゼによる分泌産物(sAPP)の増加は認められず、APP単独時には検出されなかった-セクレターゼによる分泌産物(sAPP)が検出されてきた。さらにこのsAPPの分泌増加については、Aそのものの増加が見られるSwedish型APP変異体を用いたときには、野生型APPの時よりもさらに増加する結果(約1.5倍)となった。また、ヒトTOPを単独でCOS細胞に導入したときの局在は、免疫染色の結果から大部分が核に存在し、少量がゴルジ様の構造体に局在する結果となったが、APPと共発現させたときには核に局在する量が減少してAPPの局在と重複してゴルジ様の構造体に多く局在する結果となった。

-セクレターゼについて

　-セクレターゼについても、-セクレターゼ同様に候補遺伝子産物が報告されているが、今のところ確実な報告は無い。最近一群のプロテアーゼとして細胞膜、ないし内膜系に存在する膜結合型プロテアーゼ:ADAM(a disintegrin and metalloprotease)ファミリーがAPPをはじめとした膜タンパク質の分泌に関与しているとの報告が続いている。ADAMファミリーには受精時の膜融合に関与するとされるfertilin 、、筋融合に関与するmeltrin など知られている。APPにたいしてはTNF-を前駆体フォームから成熟型に変換するTACE(TNF converting enzyme;ADAM 17)がすでに-セクレターゼ様活性を持つことが報告されている。しかしながら、TACEをknockoutしてもAPPの分泌が完全には抑制出来ないことから、他にも-セクレターゼ様活性を示すプロテアーゼが存在するのではないかと考え、比較的TACEよりも脳での発現が多くみとめられるMDC9(meltrin ;ADAM 9)に注目し研究を行った。MDC9についてはHB-EGF(heparin-binding EGF-like growth factor)をPKC依存的に切断・分泌することが報告されており、以前よりsAPPの分泌がホルボールエステルによって増加することとも一致する。

　結果:MDC9の全長(MDC9-FL)ならびにメタロプロテアーゼドメインの欠失変異体(MDC9-MP)、そしてMDC9の細胞外領域のみの変異体(MDC9-EX)を作成し、さらにそれぞれのC末端に検出・精製用にMyc-tagとHis-tagを導入したコンストラクトを作成した。これらのコンストラクトをCOS細胞に発現させたところ、MDC9-EX、MDC9-FL、MDC9-MPのいずれも糖鎖修飾を予想した分子量どおり、順に90kDa、108kDa、92kDaに検出されたが、MDC9-FLのみ予想分子量よりも25kDa程小さい83kDaのタンパク質も検出された。この83kDaタンパク質がMDC9-FLに由来するものなのかどうかを、COS細胞より部分精製し、そのN末端アミノ酸配列を決定したところ、ADAMに共通に見られる前駆体部分が切断されたメタロプロテアーゼドメインから始まるタンパク質であることが判明した。これはMDC9がCOS細胞内で糖鎖修飾をうけ、さらに全長型のみが自己消化もしくは他のプロテアーゼによって活性化型に変換されたことを示している。

　この活性化型MDC9-FL(MDC9-Pro)を用いてCOS細胞に発現させた全長APP695を切断するかを検討した結果、全長APP695はMDC9-Proによって2価金属イオン依存的に消失し、sAPPと思われる断片が生じてきた。これはin vitroで全長APPが-セクレターゼ部位で切断された初めての結果である。

　次にCOS細胞にAPP695とMDC9-FLを共発現させると、さらにTPA処理を行ったところ、sAPPの分泌増加が認められ、APP695単独発現かつTPA無処理時に比べ約10倍の分泌増加が認められた。この分泌増加はMDC9-MPとの共発現時には全く見られないか、むしろ低下していた。さらに、APP695とMDC9-FLの共発現時にメタロプロテアーゼ阻害剤を投与しておくと、sAPPの分泌は対照レベルにまで低下したことも観察された。また、このとき-セクレターゼによる分泌産物であるsAPPは、MDC9-FL+TPA処理によって全く検出されなくなったが、阻害剤を投与することで再び観察されるようになった。最後にMDC9の細胞内局在を免疫染色によって検討したところ、おもにゴルジ様の構造体に局在し、若干量が細胞膜に局在する結果を得た。この染色像はAPPと共発現しても変化は無く、APPとほぼ同様の局在を示す結果となった。