枯草菌の胞子形成過程は、細胞分化の基礎的なモデルとして古くから研究がなされており、その骨格はほぼ明らかになっている。またゲノムプロジェクトにより枯草菌全ゲノム塩基配列が明らかになり、胞子形成過程の微細な機構の解明に移りつつある。胞子形成の開始過程は、二つのprotein kinase(KinA、KinB)、二つのリン酸転移酵素(SpoOF、SpoOB)及び一つの転写因子(SPoOA)により構成されるリン酸リレー系により制御される。これらの構成要素のうち、kinAの発現とspoOF及びspoOAの胞子形成期特異的プロモーター(Ps)からの転写は^H因子に依存する。特にkinAの発現は効率的な胞子形成に必要であり、spoOAのPsからの転写は胞子形成の開始に必須であるので、^H因子の活性調節機構は胞子形成開始過程に非常に重要である。

　^H因子は対数増殖期にはほとんど存在せず、対数増殖終了前後(胞子形成開始期)になると蓄積し、活性を有するようになる。^H因子には、遺伝子発現レベルでのAbrBによる負の制御と、蛋白質レベルでの安定化・活性化による制御機構が存在するが、後者の詳細な機構については不明である。

　本論文では、小出らによってクローン化された枯草菌菌体内主要セリンプロテアーゼ遺伝子の上流に位置する機能未知遺伝子(ispU)の機能解析を行い、IspUが^H因子の活性調節に関与することを明らかにし、さらにその調節機構を明らかにしようとしたものである。

2.IspUの^H因子活性化過程への関与

　^H因子は遺伝子発現レベルでAbrBによる負の制御を受ける上、遺伝子発現後も蛋白質レベルでの安定化・活性化による制御を受けると考えられている。IspUが上記のどの段階に関与するかを明らかにするために、^H因子をコードするspoOHの発現と、胞子形成開始期における^H因子の蓄積に対するispU欠損株の影響を調べた。その結果、ispU欠損株における^H因子の遺伝子発現及び蓄積は野生株と同様に起こっていた。従ってIspUは^H因子の活性化過程に関与し、ispU欠損変異によって^H因子の活性化が30分遅れるものと推察した。

　次にIspUと^H因子が直接相互作用するかどうかを酵母のtwo-hyhbrid systemを用いて解析したが、直接の相互作用を示唆する結果は得られなかった。

　本研究は、枯草菌ispU遺伝子の機能解析を行い、IspUが^H因子の活性調節に関与することを明らかにし、さらにその調節機構を明らかにすることを目標に進められたものであり、全七章から構成されている。

　第一章において研究全体の背景について概説した後、第二章ではispU欠損株の示す現象について述べている。まず、ispUの発現が胞子形成が開始される直前に一過的に起きることから、ispUの胞子形成開始期への関与を推察した。ispU欠損株と野生株の胞子形成率には有意な差は見られないものの、ispU欠損株における胞子形成関連遺伝子の発現について詳細に解析し、^H依存的な遺伝子発現はすべて野生株と比較して約30分遅れることを明らかにした。また、耐熱性胞子の出現もispU欠損株では約30分遅れることから、ispU欠損株では胞子形成が開始段階から約30分遅れて進行することを明らかにし、lspUが^H因子の発現調節、あるいは活性調節機構に何らかの形で関与することを示した。

　第三章では遺伝子発現レベルだけでなく蛋白質レベルでの安定化・活性化による制御を受けると考えられている^H因子に対し、どの時点でIspUが関与するのかを述べている。^H因子をコードするsigHの発現と、胞子形成開始期における^H因子の蓄積に対するispU欠損株の影響を調べ、ispU欠損株における^H因子の遺伝子発現及び蓄積は野生株と同様であることを示し、IspUが^H因子の活性化過程に関与することを示した。また、酵母のtwo-hybrid systemを用いてIspUと^H因子が直接相互作用しないことを示した.

　第四章では、^H活性化に関与するlspUと同様の機能を持つ別の蛋白質を想定し、その探索について述べている。枯草菌内にIspUと同様の機能を持つ別の蛋白質が存在し、これがIspUと平行して^Hを活性化しているという仮説を立てて、ispU欠損と共存下でのみ^H活性を示さず、胞子形成が欠損となる変異株の取得を試みた。ispU欠損株においてトランスポゾン変異を行い、胞子形成欠損変異株のうち胞子形成の初期過程における変異株の中から、その変異のみでは胞子形成欠損とならないものを探索したが、目的の変異株は得られなかった。

　第五章ではIspUの6種類のparalogueと^Hの活性化について述べている。6種類のIspU paralogueの欠損変異が^Hの活性化に及ぼす影響を調べ、yojH欠損株のみがispU欠損株と同様の表現型を示すことを明らかにした。さらにispU yojH二重欠損変異では^H依存の遺伝子発現の遅れが約1時間となり、発現量も減少するが、完全に^H依存の遺伝子発現を抑制するわけではないことを明らかにした。

　第六章ではIspUと相互作用する蛋白質について述べている。IspUが、^Hの活性化に関わる蛋白質の活性を調節する機能を持っているものと考え、IspUと相互作用する蛋白質を同定し、その蛋白質の機能解析を行うことにより、^Hを活性化する蛋白質の同定を試みた。in vivoでIspUと相互作用する蛋白質の精製を試みた。精製IspUを抗原として抗IspU抗体を取得し、CNBr-activated Sepharoseカラムに固定化した。このカラムに対してT_0.5期枯草菌粗抽出液をかけたところ、分子量的32 kDa及び約30 kDaの二つの蛋白質がIspUと共精製された。このうち約30 kDaの蛋白質のN末端アミノ酸配列はYojHのものと一致したことから、IspUとYojHがin vivoで相互作用することを明らかにした。また、酵母two-hybrid screeningを用いてIspUと相互作用する蛋白質を同定することも試みた。IspUをbaitとしてGAL4-BDに接続し、超音波によりランダムに破砕した枯草菌ゲノムを用いて作製したGAL4-ADライブラリーを用いてスクリーニングを行った。いくつかの株を得たが、明確な相互作用が確認されているものはまだ見つかっていない。

　第七章の総括及び今後の展望では、IspUとYojHが^H活性化過程に関与することを示し、^B因子の活性化機構に関与するIspU paralogueのRsbR、RsbSの機能も考慮して、IspUとYojHは^Hの活性化に関わる別の蛋白質の活性を調節していると推察している。

　以上のように、本研究は細胞分化の基礎的なモデルである枯草菌の胞子形成初期過程において、因子活性化機構の調節因子の存在を明らかにしたもので、学術上、応用上貢献するところが少なくない。よって、審査委員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと判断した。