筋強直性ジストロフィーの発症機構としては、はじめに書いたようにDMPK mRNA自身や他のCUGリピートを持つmRNAの代謝異常が報告されており、CTGリピートあるいはCUGリピートそれ自体が生理作用を持つということが考えられる。そのようなリピート自体の生理作用追求の実験には、長いリピートを持つDMPKクローンの取得が有功であることは言うまでもない。しかし、リピートである上にGC含量が高いので、PCR法を用いて患者サンプルからリピート部分、あるいはリピートを含むDMPK cDNAをクローニングすることは、リピート数が100を超える場合には極めて困難でありほとんど成功した例がない。DMPKトランスジェニックマウスが作成されたが、CTGリピート数は55リピートと不十分であり、何の症状も示さないことが報告されている。実際、(CTG)₅₅リピートというのは、ヒトにおいても前発症段階と発症段階との境界にある。このような事から、私は発症の領域に入っている100個以上のリピートを保持するクローン取得の必要性を強く感じた。

　そこで私はPCR酵素とサーマルサイクラーを利用して全く新しい手法を独自に開発し、(CTG)₁₃₀、(CTG)₁₅₀、(CTG)₁₇₀、(CTG)₁₉₀という極めて長いリピートDNAを人工的に合成した。私はこれらのリピートDNAをDMPK cDNAの3’非翻訳領域に組み込むことにも成功した。このような長いリピートを持つDMPKクローンは他に例を見ない。

　また、今回、(CTG)₅、(CTG)₄₆、(CTG)₁₃₀、(CTG)₁₉₀リピートを持つDMPK cDNAを用いたin vitroにおけるmRNAの発現実験では、CTGリピート伸長はmRNAの転写効率に影響を及ぼさないとの結果を得た。この事はDM患者で見られるDMPKタンパク量の低下がmRNAの転写効率の低下によらず、mRNA代謝の異常を原因とする翻訳効率の低下によるという考えを支持する。

　まず私はヒト骨格筋とヒト脳のcDNAライブラリーからCUG-BPをクローニングした。骨格筋のライブラリーからは以前に報告されているクローンに加えて12塩基4アミノ酸(LYLQ)分の挿入のあるクローンが見つかった。脳のライブラリーからは3塩基1アミノ酸(A)分の挿入のあるクローンのみが見つかった。挿入配列以外は報告されているクローンと全く同じ配列であった。

　次に、マウス組織から抽出した全RNA及び全タンパク質を用いてノーザン解析とウェスタン解析を行った。用いた組織は脳、心臓、骨格筋、肝臓、腎臓、肺、脾臓、目、および精巣である。ノーザン解析の結果、用いた全ての組織でCUG-BP mRNAの比較的弱い発現が確認された。一方、ウェスタン解析の結果、CUG-BPタンパク質は組織特異的な発現をしていることが明らかになった。肺と脾臓で中程度の発現が見られ、脳、目、精巣で弱い発現が見られた。心臓、骨格筋、肝臓、及び腎臓では発現が見られなかった。

　COS-7細胞にDMPKとCUG-BPのcDNAを導入し、一過性に発現させた。トランスフェクションの60時間後に細胞を回収して全RNAを抽出し、DMPK及びCUG-BPの発現をノーザン解析により調べた。CUG-BPを共発現させるとDMPK mRNAの発現量は低下し、それはリピートが長い場合に、より顕著であった。

　ノーザン解析に用いたのと同じ細胞から全タンパク質を回収して、DMPKとCUG-BPについてウェスタン解析を行った。DMPKタンパク質の発現はCTGリピートが長い場合に有意に低下した。CUG-BPを発現させると、さらにDMPKタンパク質の発現が低下した。この場合もCTGリピート数が長い方が顕著に低下した。

　COS-7細胞共発現系で観察されたDMPKのタンパク質レベルでの発現低下が、ポリA長の短縮を介した翻訳効率の低下によるのかを明らかにするために、H-mapping法によりDMPK mRNAのポリA長を調べた。その結果、伸長したCTGリピートもCUG-BPもポリA長には影響を与えないことが明らかになった。

　CUG-BPと様々なRNAとの相互作用を検出するために、私は酵母two-hybrid系を改変した酵母three-hybrid系を用いた。これは2つの融合タンパク質の間を1つの融合RNAが橋渡しすることによりRNAとタンパク質の相互作用を検出できる系である。まず、私はCUGリピートとCUG-BPとの相互作用を検証した。その結果CUG-BPはin vivoにおいてもCUGリピートと特異的に相互作用することが明らかになった。CAGリピートや他の無関係なRNA配列とは相互作用しなかった。今回骨格筋から新たにクローニングした、CUG-BPの選択的スブライシング型であるCUG-BP+LYLQはCUGリピートとは相互作用せず、異なる特異性を持つことが明らかになった。

　私はこの酵母three-hybrid系を用いて、さらにCUG-BPのRNA認識配列特異性を調べた。CUG-BPのホモログとしてショウジョウバエのBrunoタンパク質とアフリカツメガエルのEDEN-BPタンパク質が知られている。Brunoタンパク質が結合するBruno response element(BRE)配列とEDEN-BPタンパク質が結合するembryo deadeny lation element(EDEN)配列は、どちらもUA及びUGの二塩基繰り返し配列に富む配列である。

　CUG-BPとEDEN-BPの高い相同性(88.4%)から、CUG-BPもUA及びUGの二塩基繰り返し配列に富む配列に結合するのではないかと考えた。酵母Three-hybridシステムを用いて相互作用を調べると、CUG-BPおよびCUG-BP+LYLQとUGリピートとの強い相互作用が検出された。CUG-BP+LYLQはUAリピートとの相互作用も検出され、ここでも選択的スプライス型ごとの特異性の違いが見られた。

　CUG-BPはembryonic lethal abnormal visual(ELAV)タイブのRNA結合タンパク質であり、3つの保存されたRNA-binding domain(RBD)を持つ。CUG-BPはN末側に2つC末側に1つRBDを持ち、その間にLinkerと呼ばれるドメインがある。RBD I、RBD II、Linker、およびRBD IIIを欠失させたコンストラクトを作製し、どのドメインがUGリピートとの相互作用に重要であるかを調べた。RBD IまたはRBD IIIを欠失させた場合には、UGリピートへの結合には全く影響が見られなかった。RBD IIを欠失させた場合には結合能が2分の1程度に低下した。意外なことにLinker部分を欠失させた場合に最も著しい結合能の低下が見られた。