A.lipoferumは複数のIAA生合成経路を有していることが示唆されているが、インドールピルビン酸(IPyA)を生合成中間体とするIPyA経路が主要なIAA生合成経路であることが示唆されている(図1)。そこで、IPyA経路における鍵酵素であるインドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ(IPDC)の遺伝子のクローニングを行った。既にEnterobacter cloacae、Azospirillum brasilense、Erwinia herbicolaにおいて取得されているipdc遺伝子の保存配列からdegenerate primerを作製し、A.lipoferumのtotal DNAを鋳型としてPCRを行ったところ、既知のipdc遺伝子と高い相同性をもつ約200bpのDNA断片が得られた。そこで、A.lipoferumのtotal DNAをSau3Alにより部分分解して得られる約32〜42kbのDNA断片をinsertとしてもつコスミドライブラリーを作製した。このライブラリーを用い、上記の約200bpのDNA断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行うことにより、一株のポジティブクローンを得ることができた。現在までに得られている塩基配列解析の結果から、このクローンがipdc遺伝子を含むことが確認され、A.brasilenseのIPDCと、アミノ酸配列において90%以上の高い相同性をもつことがわかった。また、A.lipoferumのipdc遺伝子の上流には、A.brasilenseと同様、システインおよびグルタミンのtRNA合成酵素遺伝子が存在していることも判明した。

図1 IPyA経路a,tryptophan aminotransferase;b,indole-3-pyruvate decarboxylase;c,indole-3-acetaldehyde dehydrogenase or indole-3-acetaldehyde oxidase

　IAAの生合成の制御機構は、現在までのところほとんどわかっていない。ごく最近になってA.brasilenseにおいて、ipdc遺伝子の発現がIAAによってupregulateされることが示されたが、その発現制御機構に関する分子レベルの知見は全く得られていない。そこで本研究では、ipdc遺伝子の発現制御機構を解明するために、ipdc遺伝子のプロモーター領域を含む5’上流域の解析を行うことにした。A.lipoferumのipdc遺伝子のプロモーター領域を含む5’上流域はA.brasilenseと極めて類似しており、A.lipoferumにおいても同様にIAAの生合成がオーキシンによりupregulateされていると考えられる。

　A.lipoferumのipdc遺伝子の5’上流域では、プロモーター領域であると考えられる20bpのinverted repeat sequence(IRS)が存在していた。これはこの領域に結合するタンパク質の存在を示唆するものであり、この未知なるDNA結合タンパク質によってipdc遺伝子の発現が制御されている可能性が考えられた。そこで、A.lipoferumの菌体破砕液をDEAE Sepharoseカラムで分画し、得られた各画分についてgel mobility-shift assay(GMSA)を用いて、ipdc遺伝子の5’上流域に結合することのできるタンパク質の存在を調べた。その結果、ipdc遺伝子の5’上流域(約130bp)に結合する2種のタンパク質の存在が認められた。

　次に、上記DNA結合タンパク質の結合領域を明らかにするために、IRSを含む約40bpの塩基配列を3〜17bpずつ改変した10数種の2本鎖オリゴヌクレオチドを作製し、それらのオリゴヌクレオチドと本来の配列を有する標識プローブとの拮抗をGMSAにより調べることで、結合領域のfine mappingを行った。その結果、移動度の小さいshift bandについてはIRS内に塩基置換をもつどのオリゴヌクレオチドとも拮抗が認められないことが示された。一方、移動度の大きいshift bandについては、IRSを構成する塩基配列のうち、片側の8塩基およびその周辺の塩基配列が置換されたオリゴヌクレオチドのみ、拮抗が観察されなかった。以上の事実は、移動度の小さいband shiftを引き起こすDNA結合タンパク質(以下、AIDBP)がDNAとの安定な複合体を形成するにはIRSを構成する塩基配列の全てが必要であり、また、移動度の大きいband shiftを引き起こすDNA結合タンパク質(以下、ADDBP)は、IRSを構成する塩基配列のうち、片側の8塩基およびその周辺の塩基配列を必要としていることを示唆している(図2)。

図2 ipdc遺伝子の5’上流域の配列□はAIDBPが結合する領域を、はADDBPが結合する領域を表す。*印はinverted repeat sequence

　IAAの生合成において、鍵酵素であるipdc遺伝子の5’上流域に結合能を有するタンパク質が存在していたことは大変興味深い。微生物では、目的とする最終産物が、転写のactivatorもしくはrepressorとして働く制御タンパク質に直接相互作用することで、自らの生産を制御する例がいくつか知られている。A.lipoferumにおいても、ipdc遺伝子の発現を制御していると思われるタンパク質とオーキシンが相互作用している可能性が考えられる。そこで、A.lipoferumの細胞抽出液をDEAE Sepharoseカラムで分画したものに終濃度3mMのIAA、2,4-D、ナフタレン酢酸(NAA)そしてTrpを添加し、上記の二つのDNA結合タンパク質(AIDBPおよびADDBP)のipdc遺伝子5’上流域への結合能の変化をGMSAを用いて調べた。その結果、AIDBPはIAA、2,4-D、NAAおよびTrpの添加により影響を受けないが、ADDBPはTrpの添加では影響を受けないものの、IAA、2,4-D、NAAを添加することでshift bandが消失することがわかった。以上の結果から、ipdc遺伝子の5’上流域に結合するAIDBPはオーキシン非依存性DNA結合タンパク質であり、ADDBPはオーキシン依存性DNA結合タンパク質であると考えられる。すなわち、IAA生合成酵素遺伝子であるipdc遺伝子は、オーキシン非依存性のタンパク質と、オーキシン依存性の2種のタンパク質によって、その発現を制御されていることが示唆された。近年、植物においてIAA誘導性遺伝子の上流、もしくは下流に存在するauxin responsive elementと呼ばれる6塩基程度の配列が注目されている。本研究で明らかになったDNA結合タンパク質の結合領域にも類似した配列が存在していることから、オーキシンによる遺伝子発現において、植物・微生物で共通の制御メカニズムが機能している可能性がある。今後、A.lipoferumにおいてIAA生合成の制御に関係すると思われるオーキシン依存性DNA結合タンパク質について解析を進めることは、これまでほどんど未解明のオーキシン生合成の制御機構の解明のために極めて重要な知見を提供するものと考えられる。