| 内容要旨 | | 序 当研究室ではこれまでcarbazole資化菌Pseudomonas sp.CA10株のcarbazole分解代謝経路を明らかにし,分解に関わるcarbazole分解代謝系酵素遺伝子群の塩基配列の決定とそれら酵素の機能解析を行ってきた。1)その過程で取得されたcarbazole 1,9a-dioxygenase(CARDO)は,その後の研究により,本来の基質であるcarbazole以外にも,近年環境汚染物質として大きな社会問題となっているダイオキシンのモデル化合物であるdibenzo-p-dioxinやdibenzofuranの他,naphthalene等のpolycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)の酸化反応も触媒する事が明らかとなった。すなわち,carbazoleやdibenzo-p-dioxinに対してはヘテロ原子の隣の核間とそれに隣接する炭素原子に対する二酸素原子添加反応(angular dioxygenation)を触媒する一方,naphthalene,anthracene等のPAHsに対しては核間とは異なる部位にcis-dihydroxylationを触媒しdihydrodiol体を生成する反応を,またdibenzothiopheneに対してはsulfoxidationを触媒することが示された。2)このようにCARDOは非常に広い基質特異性を有しており,また報告例の少ないangular dioxygenaseとしての働きを持つ新規性の高い酵素であるため,その基質認識と反応機構について興味が持たれる。 CARDOはterminal oxygenase(CarAa),ferredoxin(CarAc),ferredoxin reductase(CarAd)から成るmulticomponent dioxygenaseであるため,活性を有する酵素を得るには各々のcomponentを精製し再構成する方法が考えられる。そこで本博士論文研究では,CARDOの基質認識と反応機構を明らかにする事を最終的な目的として,CARDOの各componentの精製と,性質の解明を行うとともに,各々のcomponentの結晶化の条件検討を行った。また,CARDOを進化的側面から理解するため行った系統学的研究から,現在まで広く使われてきたdioxygenaseの分類系の問題点を見いだし,terminal oxygenase componentの subunitのみのアミノ酸配列の相同性による新しい分類系を提案した。 1.ベクターの構築と発現条件の検討 精製を容易にするために,各々のcomponentを一つずつコードする発現ベクターの構築を行った。また,それを用いた場合の,大腸菌宿主,生育温度,IPTG終濃度等の生育・誘導条件の違いが当該タンパク質の可溶性タンパク質としての発現量に及ぼす影響について検討した。CarAaの大量発現のために,CarAaをコードする遺伝子断片をPCR反応と制限酵素処理により取得し,発現ベクターpET-26b(+)のNdel-EcoRI領域に挿入した。大腸菌BL21(DE3)株を宿主として用い終濃度0.05-0.1mMのIPTG,LB培地,25℃で16時間生育させる条件により目的のタンパク質を著量発現させる事に成功した。CarAcとCarAdの場合は,各々His-tagged proteinとして発現するようにベクターを設計した。PCR法により増幅した各々をコードする領域を含むDNA断片を,pET-26b(+)のXbal-Xhol siteに挿入した。このプラスミドを保持する大腸菌BL21(DE3)株を,終濃度0.5mMのIPTGを含むLB培地等で30℃,12時間培養することで,著量のCarAc,CarAdを発現させた。発現させたCARDOの各componentを含むcrude extractを用いてCARDOの再構成を行い,carbazoleの変換産物である2’-aminobiphenyl-2,3-diolをTMS化しGC-MSを用い検出する方法によりCARDOの酸化活性を検討した結果,いずれのタンパク質とも活性を保持した形で発現されている事が明らかになった。 2.CarAa,CarAc,CarAdタンパク質の精製 CARDOの活性評価系としてGC-MSを用いる場合,反応産物の検出は可能であるが,TMS化された2’-aminobiphenyl-2,3-diolは二つのピークとして示される等,定量性に問題があった。そこで新しい活性測定系として,RI標識したcarbazoleを基質として反応後,TLCにより反応生成物を分離しscintillation counterによりその量を定量する方法を確立した。この方法によりCarAaとCarAcの精製過程の活性評価を行った。一方,CarAdはNAD(P)H dependent oxidoreductaseとしての活性を持っているためその活性測定法により活性を評価した。 発現条件の検討結果に従い,目的のタンパク質を発現させて,各々のcomponentの精製を行った。CarAaの精製には10%glycerolを含む20mM Tris-HCl(pH7.5)とTris-H2SO4(pH7.5)buffer systemを使用し,DEAE Sepharose CL-6B(Pharmacia),POROS HQ/L(PE Biosystems)カラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーと,Sephacryl S-200(Pharmacia)カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーを行い2 literの培養液から比活性約110 U/mgのタンパク質を約2mg得た。CarAaはアミノ酸配列から鉄硫黄クラスターとFe2+含んでいる事が予想されており,精製されたタンパク質は鉄の存在に起因すると考えられる褐色を呈していた。SDS-PAGEによる分子量は約44,000と推測され,推定アミノ酸配列から予想される分子量と良い一致を示し,また,ゲルろ過クロマトグラフィーの結果からは約160,000の分子量が示された事から,CarAaは4量体のタンパク質である事が推測された。His-tagged proteinとして発現させたCarAcとCarAdはHisTrap(Pharmacia)カラムを用いた金属chelationクロマトグラフィーと,Sephacryl S-200カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより精製し,2 literの培養液から各々約1.5mgずつの精製タンパク質を得た。アミノ酸配列から鉄硫黄クラスターを含んでいる事が予想されたCarAcも褐色を呈したタンパク質であり,また,アミノ酸配列から鉄硫黄クラスターとflavinを保持することが予想されたCarAdの精製タンパク質は茶黄色を呈していた。分離精製された各々のタンパク質はSDS-PAGEのCBB染色の結果からほぼ単一であることが示され,また,N末端アミノ酸シーケンスの結果からは,各々目的のタンパク質が精製されたことが確認された。 3.精製タンパク質の性質 NAD(P)H dependent oxidoreductaseとしての活性を持っているCarAdはcytochrome cまたは2,6-dichlorophenolindophenol(DCPIP)を電子受容体として活性を評価した。その結果,CarAd活性の至適pHはpH8.0-8.5,至適温度は35-45℃であることが示された。また,NADHとNADPHの mは各々3.7 Mと79.5Mであり,その時のVmaxは各々16.9U/mgと25.6U/mgであることも明らかとなった。CarAdはDCPIPとcytochrome c以外にもnitrobluetetrazoliumとferricyanideを電子受容体とし,NAD(P)Hからの電子を伝達した。活性系に1 M flavin adenine dinucleotide(FAD)を添加した場合に活性が25%以上上昇した事,さらにCarAdを煮沸して得られた上清液のHPLC分析によりFADが検出された事から,CarAdはcofactorとしてFADを保持していることが明らかとなった。 また,精製した各componentについて分光学的研究を行ったところ,CarAaとCarAcはRiesketypeの鉄硫黄クラスター特有のUV-可視光吸収スペクトルを示した。CarAdはflavinを含んだ吸収スペクトルを示した。 一方,精製した各componentを用い再構成したCARDOは,pH7.0-7.5,30℃の条件においてmaximum activityを示した。反応系にNADH,FAD,Fe2+を添加した場合にNADHのみが含まれる場合より40%以上高い活性を示した事から,FADとFe2+により再構成したCARDOが活性化されることが明らかとなった。 4.精製タンパク質の結晶化 精製した各々のタンパク質の結晶化条件の検討を,Crystal Screen kit1と2(Hampton Research Co.)を用いhanging-drop vapor diffusion法により行った。その結果,CarAaは0.5M ammonium sulfate,1.0M lithium sulfate,0.1M sodium citrate(pH5.6),20℃の条件において,静置三日目にhexagonal plate型の褐色を呈した結晶の生成が認られ,最大約0.3×0.3×0.1mmの大きさのものが観察された(Fig.1)。この結晶の予備的なX線回折実験の結果,結晶系は六方晶系であり,格子定数はa＝b＝245.3Å,c＝70.9Å,＝ ＝90゜, ＝120゜である事が示された。CarAaにおいては上記の条件以外にも針状の結晶がいくつかの別の条件で得られている。また,His-tagged CarAc,His-tagged CarAdも各々結晶化条件の検討を行った結果,現在までにHis-tagged CarAcでは針状の結晶の生成が1.6M ammonium sulfate,10%(v/v)dioxane,0.1M MES(pH6.5),5℃などのいくつかの条件下で認められている。 5.Aromatic ring-hydroxylating dioxygenaseの新しい分類系の提案 CARDOが属するaromatic ring-hydroxylating dioxygenaseのclassification systemとして,Batieら3)により提案された,電子伝達系の構成と性質に関わる生化学的分類系が主に使用されてきた。Batieらのclassification systemにより,oxygenaseは三つのclassに分類される。しかし最近新しいoxygenaseが発見されるに伴い,Batieらのclassification systemに当てはまらない例が増えてきた。CARDOと2-oxo-1,2-dihydroquinoline 8-monooxygenaseがその代表的な例であり,各々の酵素は全体としてはBatieらのclassification systemのclass IIIとclass IBに属するが,それらのterminal oxygenase componentは系統学的な研究からはclass IAのものに近いことが明らかになっている。この不一致は,構成するcomponent全てを考慮し,酵素全体で分類を行ったことが原因である事に着目し,terminal oxygenaseの subunitのアミノ酸配列の相同性を調べた結果から新しい分類系の構築を試みた。既知の54個のoxygenase systemのterminal oxygenaseの subunitをCLUSTALWを用いてpairwiseで比較し,得られたscoreを基にしてoxygenaseを分類した。その結果,Fig.2に示す様にoxygenaseは四つのグループ [Group I,homo-multimer oxygenases;Group II,benzoate/toluate dioxygenases;Group III,naphthalene/PAHs dioxygenases;Group IV,benzene/toluene/biphenyl dioxygenases]に分類された。この新しい系はoxygenase componentを塩基配列のみでほぼ自動的に分類するとともに系統学的側面を良く反映しており,単純ながらも強力な分類系と言うことができる。  図表Fig.1(↑).CarAaの結晶(約0.3×0.3×0.1mm) / Fig.2(→).Pairwise sequence alignment scoreによるoxygenaseの新しいgroupingまとめと展望 本研究では,CarAa,CarAc,CarAd各々のタンパク質を精製し,各々のタンパク質の性質と,再構成されたCARDOの性質を調べた。また,各々のタンパク質について結晶化条件検討を行い,CarAaの六方晶系の結晶が得られた。今後,X線構造解析によりCARDOの三次元構造が明らかになればCARDOの基質認識と反応機構についての有用な知見が得られ,ダイオキシン等のbioremediationの有効な手段として強力な酵素の開発にも応用できるものと期待される。一方,CARDOが属するoxygenase familyの新しい分類系を提案し,今後,既存のBatieらによる分類系では説明できなかったoxygenaseの分類に役立つとともに,oxygenase familyに関する系統的な理解に寄与する事が期待される。 References1)Sato,S.,J.-W.Nam,K.Kasuga,H.Nojiri,H.Yamane,T.Omori.1997.Identification and characterization of genes encoding carbazole 1,9a-dioxygenase in Pseudomonas sp.strain CA10.J.Bacteriol.179:4850-4858.2)Nojiri,H.,J.-W.Nam,M.Kosaka,K.Morii,T.Takemura,K.Furihata,H.Yamane,and T.Omori.1999.Diverse oxygenations catalyzed by carbazole 1,9a-dioxygenase from Pseudomonas sp.strain CA10.J.Bacteriol.181:3105-3113.3)Batie,C.J.,D.P.Ballou,and C.C.Correll.1991.Phthalate dioxygenase reductase and related flaviniron-sulfur containing electron transferases.Chemistry and Biochemistry of Flavoenzymes 3:543-556. |
| 審査要旨 | | 本研究では,carbazole資化菌Pseudomonas sp.CA10株のcarbazole 1,9a-dioxygenase(CARDO)の基質認識と反応機構を明らかにする事を最終的な目的として,CARDOの構成componentであるterminal oxygenase(CarAa),ferredoxin(CarAc),ferredoxin reductase(CarAd)の精製と,性質の解明を行うとともに,各々のcomponentの結晶化の条件検討を行った。また,CARDOを進化的側面から理解するため行った系統学的研究から,現在まで広く使われてきたoxygenaseの分類系の問題点を見いだし,terminal oxygenase componentの subunitのみのアミノ酸配列の相同性による新しい分類系を提案した。 第1章の序論に引き続き,第2章では,精製を容易にするために,各々のcomponentを一つずつコードする発現ベクターの構築を行い,それを用いた場合の,大腸菌宿主,生育温度,IPTG終濃度等の条件の違いが当該タンパク質の可溶性タンパク質としての発現量に及ぼす影響について検討した。 第3章においては,まず,RI標識したcarbazoleを用いたCARDOの活性測定系を確立した後,第2章の発現条件の検討結果に従い目的のタンパク質を発現させ,精製を行った。CarAaはイオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーにより精製し,2 literの培養液から比活性約110U/mgのタンパク質を約2mg得た。SDS-PAGEによる分子量は約44,000と推測され,推定アミノ酸配列から予想される分子量と良い一致を示し,また,ゲルろ過クロマトグラフィーの結果からは約160,000の分子量が示された事から,CarAaは4量体のタンパク質である事が推測された。His-tagged proteinとして発現させたCarAcとCarAdは金属chelationクロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーにより精製し,2 literの培養液から各々約1.5mgずつの精製タンパク質を得た。精製された各々のタンパク質はSDS-PAGEのCBB染色の結果からほぼ単一であることが示され,また,N末端アミノ酸シーケンスの結果からは,各々目的のタンパク質が精製されたことが確認された。 第4章では,精製タンパク質の基本的な性質を調べた。NAD(P)H dependent oxidoreductaseとしての活性を持っているCarAdはcytochrome cまたは2,6-dichlorophenolindophenol(DCPIP)を電子受容体として活性を評価した。その結果,CarAd活性の至適pHはpH8.0-8.5,至適温度は35-45℃であることが示された。NADHとNADPHのKmは各々3.7Mと79.5M,Vmaxは各々16.9U/mgと25.6U/mgであった。CarAdはnitrobluetetrazoliumとferricyanideも電子受容体とし,NAD(P)Hからの電子を伝達した。活性系にFADを添加した場合に活性が上昇した事と,CarAdを煮沸して得られた上清液のHPLC分析によりFADが検出された事から,CarAdはcofactorとしてFADを保持していることが明らかとなった。また,精製した各componentについて分光学的研究を行ったところ,CarAaとCarAcはRieske typeの鉄硫黄クラスター特有のUV-可視光吸収スペクトルを示し,CarAdはflavinを含んだ吸収スペクトルを示した。一方,精製した各componentを用い再構成したCARDOは,pH7.0-7.5,30℃の条件において最大活性を示した。反応系にNADH,FAD,Fe2+を添加した場合にNADHのみが含まれる場合より高い活性を示した事から,FADとFe2+により再構成したCARDOが活性化されることが明らかとなった。 第5章では,精製した各々のタンパク質の結晶化条件の検討を,Crystal Screen kit 1と2(Hampton Research Co.)を用い蒸気拡散法により行った。CarAaは0.5M ammonium sulfate,1.0M lithium sulfate,0.1M sodium citrate(pH5.6),20℃の条件において,静置三日目にhexagonal plate型の褐色を呈した結晶の生成が認られ,最大約0.3×0.3×0.1mmの大きさのものが観察された。この結晶の予備的なX線回折実験の結果,結晶系は六方晶系であり,格子定数はa＝b＝245.3Å,c＝70.9Å,＝＝90°,＝120゜である事が示された。 第6章では,aromatic ring-hydroxylating dioxygenaseの新しい分類系を提案した。CARDOが属するoxygenaseのclassification systemとして,Batieらにより提案された,電子伝達系の構成と性質に関わる分類系が主に使用されてきたが,最近新しいoxygenaseが発見されるに伴い,Batieらのclassification systemに当てはまらない例が増えてきた。CARDOと2-oxo-1,2-dihydroquinoline8-monooxygenaseがその代表的な例であり,各々の酵素は全体としてはBatieらのclassification systemのclass IIIとclass IBに属するが,それらのterminal oxygenase componentは系統学的な研究からはclass IAのものに近いことが明らかになっている。この不一致は,構成するcomponent全てを考慮し分類を行ったことが原因である事に着目し,terminal oxygenaseの subunitのアミノ酸配列の相同性を調べた結果から新しい分類系の構築を試みた。既知の54個のoxygenase systemのterminal oxygenaseの subunitをCLUSTAL Wを用いてpairwiseで比較し,得られたscoreを基にしてoxygenaseを分類した。その結果,oxygenaseは四つのグループ[Group I,homo-multimer oxygenases;Group II,benzoate/toluate dioxygenases;Group III,naphthalene/PAHs dioxygenases;Group IV,benzene/toluene/biphenyl dioxygenases]に分類された。この新しい系はoxygenase componentを塩基配列のみでほぼ自動的に分類するとともに系統学的側面を良く反映しており,単純ながらも強力な分類系と言うことができる。 以上,本論文では,CarAa,CarAc,CarAd各々のタンパク質を精製し,その性質を調べると共に,各々のタンパク質について結晶化条件検討を行い,CarAaの六方晶系の結晶を得た。今後,X線構造解析によりCARDOの三次元構造が明らかになればCARDOの基質認識と反応機構についての有用な知見が得られ,ダイオキシン等のbioremediationの有効な手段として強力な酵素の開発にも応用できるものと期待される。一方,CARDOが属するoxygenase familyの新しい分類系を提案し,今後,既存のBatieらによる分類系では説明できなかったoxygenaseの分類に役立つとともに,oxygenase familyに関する系統的な理解に寄与する事が期待される等,学術上,応用上貢献するところが少なくない。よって,審査委員一同は,本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと判断した。 |