まず、cAMP処理によりIRS-2量が増加するかどうか調べるために、cAMP存在下・非存在下で24時間培養した細胞の抽出液を抗IRS-2抗体によるイムノブロッティングに供した結果、cAMP処理によりIRS-2量は増加しないことが明らかとなった。そこで、cAMP処理によりIRS-2に何らかの修飾が起こり、IGF-Iレセプターキナーゼにリン酸化されやすくなる可能性を検討した。すなわち、cAMP処理した細胞・非処理の細胞からそれぞれ免疫沈降によってIRS-2を調製し、次に、あらかじめ精製した活性型IGF-IレセプターをATPとともに加え、in vitroリン酸化反応を行い、IRS-2のチロシンリン酸化を比較した。その結果、cAMP処理細胞より調製したIRS-2のチロシンリン酸化量が有意に増加した。更に、それぞれの細胞から調製したIRS-2を、アルカリホスファターゼ処理をしてセリン/スレオニンリン酸化を除去する、あるいは高塩濃度で洗浄しIRS-2に結合しているタンパク質を除去する処理をした後に、in vitroリン酸化反応を行ったところ、IRS-2のチロシンリン酸化の増加が認められなくなった。cAMP処理後のIRS-2がセリンリン酸化されている結果を併せると、cAMP処理によりIRS-2のセリン/スレオニンリン酸化、かつ、何らかのタンパク質の結合により、IRS-2とIGF-Iレセプターとの親和性が高まり、IRS-2のチロシンリン酸化量が増加すると考えられた。

　Shcには、分子質量66kDa,52kDa,46kDaの3つの分子種が存在することが知られている。まず、cAMP処理後のそれぞれのタンパク量を調べたところ、cAMP処理時間および濃度に依存してp66 Shcの量が顕著に増加することを発見した。この結果から、cAMP処理によるp66 ShcのIGF-I依存性チロシンリン酸化の増強の少なくとも一部は、p66 Shc量の増加によって説明できると考えられた。一方、Shc遺伝子は、alternative splicingによってp66,p52,p46をコードする長いmRNAとp52,p46をコードする短いmRNAの2種類を生成し、それぞれのmRNA上の異なる翻訳開始点を利用して、3種類の分子種が作られることが明らかになっている。そこで、ノザンブロッティングによりShc mRNAの量を測定したところ、p66をコードするmRNAは、cAMP処理時間および濃度依存的に著しく増加した。p66をコードするmRNAは同時にp46,p52もコードしていることから、cAMPに応答して選択的にp66の翻訳を促進するような機構の存在も示唆していた。これらの結果より、Shcは、cAMP処理に応答して転写・翻訳が活性化され、特にp66 Shcが増加するため、IGF-Iレセプターによるチロシンリン酸化が増強されると結論した。

　IGF-Iなどの増殖因子の刺激により、IRSやShcなどがチロシンリン酸化されると、リン酸化チロシン残基を認識してSH2ドメインを有するGrb2が結合し、その結果Grb2と結合しているGDP/GTP交換因子Sosが細胞膜近くに運ばれる。Sosは膜にanchoringしているGタンパク質Rasを活性化、Rasが複数のMAP kinaseカスケードを活性化して、細胞の増殖および分化を誘導することが知られている。そこで、まず、cAMP前処理後IGF-Iで処理した際にチロシンリン酸化IRS-2,Shcと結合するGrb2量を測定した。その結果、cAMP前処理により、IGF-I依存的なIRS-2とGrb2の結合はやや増加し、ShcとGrb2の結合は顕著に増加することがわかった。続いて、cAMP前処理がIGF-I依存性MAP kinase活性化に及ぼす影響について検討した。一般に、複数のMAP kinaseファミリーのうち、p42/44 Erkは増殖因子に応答して活性化されるのに対して、p38 MAP kinaseはストレスやサイトカインに応答して働くと考えられている。まず、cAMP前処理によりIGF-I依存的なp42/44Erk活性化は増強されたが、驚いたことに、IGF-I依存的なp38 MAP kinase活性化も、cAMP前処理により顕著に増強され、その増強の程度は、p42/44 Erkの場合よりも大きいことが明らかとなった。次に、静止期のFRTL-5細胞をdibutyryl cAMP存在下・非存在下で培養後、p42/44 Erkを活性化するMEKの阻害剤PD98059またはp38 MAPK阻害剤SB203580をIGF-Iと共に添加し、更に24時間培養、DNA合成量を測定した。その結果、PD98059はcAMP前処理後のIGF-I依存性DNA合成の相乗的な増強を約30%、SB203580は約70%抑制し、更に、PD98059とSB203580を同時に添加すると、増強は完全に抑制された。これらの結果から、MAP kinaseカスケードの活性化は、cAMPによるIGF-I誘導性DNA合成の増強に必須であることが明らかとなった。

　IRSのリン酸化チロシン残基は、PI 3-kinase p85調節サブユニットのSH2ドメインにより認識されることも報告されている。IRSに相互作用したPI 3-kinaseは、細胞膜中のPIをリン酸化、この産物によりシグナル分子が細胞膜近くに呼び寄せられたり、酵素が活性化されたりすることにより、下流にシグナルが伝えられ、このPI 3-kinaseカスケード活性化も、細胞増殖や分化誘導、細胞死の抑制などに重要なシグナル伝達系と考えられている。そこで、cAMP前処理後、IGF-Iで刺激した際のIRS-1およびIRS-2に結合するp85 PI3-kinase量を測定したところ、cAMP前処理によりIGF-I依存的にIRS-2に結合するp85の量が相乗的に増加し、IRS-2のチロシンリン酸化の増強をよく反映する結果となった。さらに、我々のグループの研究成果から、IRS-2に結合するPI 3-kinase活性も、IRS-2とp85の結合量と良く相関していることが明らかとなっている。一方、IGF-I依存性IRS-1のチロシンリン酸化はcAMP前処理により変化しなかったが、IRS-1に結合するp85の量およびPI 3-kinase活性は有意に減少した。このように、cAMP前処理により、IRS-1とIRS-2は、IGF-I依存的なチロシンリン酸化、PI 3-kinaseとの結合量の2つの段階で異なる制御を受けることを初めて見出した。また、cAMP前処理後、IGF-Iで24時間処理する際にPI3-kinaseの阻害剤であるLY294002を添加した結果、cAMPにより増強されるIGF-I誘導性DNA合成が完全に抑制された。これらの結果は、cAMP前処理によるIGF-I依存性IRS-2のチロシンリン酸化の増強を介して、相乗的に強められたPI 3-kinaseの活性がcAMPとIGF-Iによる相乗的な増殖誘導に重要な役割を果たすことを示している。