ラット脳cDNAライブラリーからplaque hybridizationによってスクリーニングし、完全長のDnmt1 cDNAを単離した。ラットDnmt1は1,622アミノ酸よりなり、ヒト、マウスのDnmt1とそれぞれ、64.2%、および88.3%の相同性を示した。N末端より増殖細胞核抗原(PCNA)結合モチーフ、双極型核局在シグナル(NLS)、複製領域集積配列(RFTS)、Zn結合モチーフ、Polybromo-1 homologous domain(PBHD)、酵素触媒ドメインを有していた。Dnmt1の発現と細胞の増殖・分化の関係を、正常二倍体細胞(NRK細胞)と胎盤栄養膜巨細胞へと誘導可能な細胞株Rcho-1細胞を用いて調べた。Rcho-1細胞は分化開始後もDNA合成を継続し、最終分化したRcho-1細胞は正常細胞の約50倍以上のゲノムDNAを持つ。NRK細胞では血清除去により細胞増殖を停止させた場合、Dnmt1量は著しく低下し、転写活性が休止期に低下する先の報告と一致した結果を得た。ところが、Rcho-1細胞では、分化誘導開始4日目にもDnmt1は増殖時と変わらず豊富に存在していることが明らかになった。このとき、Dnmt1 mRNA量も分化誘導前と変わらず、Rcho-1細胞においても酵素量が転写により調整されていることが明らかになった。ところが、分化誘導開始後8日目には、Dnmt1 mRNA量が維持されているにもかかわらず、酵素タンパク量は大きく低下していることが判明し、転写後の調節機構が分化細胞で重要な調節点であることがわかった。したがって、細胞内のDnmt1量は、少なくとも転写段階と転写後の2段階の制御を受けていることになる。

　維持DNAメチル基転移活性の発現のためには、Dnmt1はS期にDNA複製部位に存在しなけらばならない。Dnmt1には、上記のように典型的なNLSやRFTS配列が存在する。本章では様々なDnmt1欠損変異体を細胞内で一過的に発現させることで、Dnmt1の核局在を中心に解析した。C末端からの連続欠損変異体はRFTSを欠損すると核内に局在はするが複製部位への局在が見られなくなる。また、NLS欠損変異体では核への局在はなくなり、細胞全体に拡散した像が見られた。したがって、NLSやRFTSは配列から予想されるとおり機能していると考えてよい。しかし、N末端からの欠損変異体では、NLSを含む場合でも、170アミノ酸を欠くと細胞質に強く存在することが明らかになり、NLS以外に核移行に不可欠な領域がN末端側に存在することが明らかになった。興味深いことに、NLSのみ欠損した変異体では、核移行およびDNA複製部位への局在が認められた。Dnmt1のN末端(1-170アミノ酸)にはNLS以外に核移行の情報が備わっており、RFTSと共同してDNA複製部位に滞在することが可能になるのである。NLSを含まないDnmt1断片(80-158アミノ酸)-GFP融合蛋白質(GFP-Dnmt1)を用いた実験より、Dnmt1は分子内の80-158アミノ酸ドメイン(Nuclear Localization Domain,NLD)も使って核内局在を制御していることが明らかになった。

　Dnmt1がメチル化パターンを娘鎖DNAに伝えるためには、親鎖DNAのメチル基を認識する機構が存在するはずであるが、一次構造の中には、従来報告されているメチル化認識タンパクの有するモチーフは見られない。Dnmt1はメチル化認識タンパクとの結合を介して親鎖のメチル化DNAを認識している可能性が考えられる。メチル結合タンパク2(MeCP2)はmCpGに結合することができる代表的分子である。そこでMycタグ融合野生型およびC末端からの連続欠損変異体Dnmt1とFLAGタグ融合MeCP2を293T細胞で共発現させ、タグ抗体を用いた免疫沈降実験からin vivoで結合するか否かを調べた。その結果、野生型Dnmt1はMeCP2と共に沈殿されることがわかった。しかも、RFTSモチーフを含む欠損変異体Dnmt1とはMeCP2は結合するが、同モチーフを欠く変異体では全く結合しないことも明らかになった。さらに、Dnmt1のMeCP2との結合部位(MeCP2結合部位、MPBS)はRFTSのN末端側に存在することもわかった。その場合、RFTSのC末端側は別のDNA複製関連タンパクと反応していることになる。以上より、Dnmt1分子内にMeCP2結合部位が存在していることを証明した。複製領域近傍でMeCP2と結合することは、DNA複製時のDNAメチル化パターンを娘鎖DNAに継承・維持するための中心的機構であるに違いない。

　多くの核タンパクで見られるように、Dnmt1もリン酸化による制御を受けている可能性は十分に考えられる。本章ではNRK細胞を用いてin vivo[³²P]正リン酸で標識し、免疫沈降とリン酸化アミノ酸分析によって解析した。その結果、Dnmt1のSerがリン酸化されることを見いだした。連続欠損変異体Dnmt1を用いた実験で、C末端から1,421アミノ酸を除去しても強いリン酸化シグナルが見られ、逆に、N末端から153アミノ酸を除いた場合にはリン酸化シグナルは著しく低下した。すなわち、NLDを含む領域にリン酸化部位が存在することになる。そこで、NLD内で哺乳類で保存されているSerをAlaに置換した点変異体Dnmt1を293T細胞で発現させ、同様にリン酸標識実験で解析した結果、Ser125およびSer128のリン酸化が安定性に重要であることが明らかになった。さらに、in vitro Kinase AssayによってNLDはCdk2によってリン酸化されること、GST-NLD融合タンパクを使ったGST-Pull Down Kinase Assayによって未知のkinaseが結合することも明らかになった。したがって、これらのSerのリン酸化はDnmt1の細胞内での細胞周期依存的安定性に重要な機能を果たしていることがわかった。