骨髄細胞から5’,および3’RACE法によりそれぞれバンド3cDNAを単離し、塩基配列を解析した。cDNAから推定される牛赤血球バンド3は930アミノ酸残基(Mr＝105,000)から構成され、N-末端領域を除き、高い種間相同性が見られた。同様に、バンド3を完全に欠損する牛の骨髄から赤血球バンド3cDNAを単離し正常配列と比較した結果、664番目のコドンにCGA→TGA;Arg⁶⁶⁴→Stop(R664X変異)が唯一の変異として見出された。これは既報のヒトバンド3の646番目のコドンに相当するものであった。

　R664X変異によって、近傍にDra III切断部位が生じる。これを利用してPCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)によりR664X変異に関する遺伝子型を同定する方法、同様にPCR-SSCP(single strand conformation polymorphism)を確立した。

　上紀のPCR-RELP法により約150頭の黒毛和種牛個体について遺伝子型を解析し、遺伝子型と赤血球形態、バンド3含量、ならびに赤血球のニオン輸送活性との関連を検討した。

　赤血球形態:ホモ接合型個体は、全例(n＝8)が大小不同をともなう重度の球状赤血球症を呈し、ほぼ全ての赤血球が球状で、小胞化、断片化、内方陥没が認められた。ヘテロ個体においても典型的な球状赤血球症が認められ、ほとんどの赤血球が有口、あるいは球状赤血球であった。

　膜蛋白質:全てのホモ接合型でバンド3の完全欠損が確認された。ヘテロ接合型ではバンド3含量が正常の約70%に低下していた。またプロテイン4.1a/b比は、ホモで顕著に、またヘテロでも有意な低下を示し、赤血球崩壊と造血の亢進が示された。

　アニオン輸送:ヘテロ接合型赤血球の硫酸イオン(³⁵SO₄^2-)輸送活性と、バンド3の特異的阻害剤であるDIDS(diisothiocyanostilbene disulfonate)の結合量は、ともに正常赤血球の約70%に減少していた。ホモ接合型赤血球のSO₄^2-輸送活性は正常赤血球の2%以下と著しく低値で、かつDIDSに非感受性であった。

　これらの成績から、ヘテロ接合型赤血球が、正常とホモ接合型の中間的な形質異常を有すること、即ち、R664X変異に関する遺伝子型と赤血球表現型とがよく一致することが判明した。

　正常配列のバンド3cDNAクローン(pBEB)、ならびにR664X変異クローン(pBEBRX)から合成したRNA(それぞれBEBとBEBRX)をXenopusoocytesに注入したところ、BEBではDIDS感受性の塩素イオン(Cl^-)輸送の発現がみられたが、BEBRXを注入したXenopus oocytesのCl^-輸送能は対照として水を注入したものと同程度であった。したがって、R664X変異は、少なくともバンド3の機能欠損を引き起こす変異であることが明らかになった。

　以上の知見から、このR664X変異が黒毛和種牛バンド3欠損症の原因遺伝子異常であること、本疾患が常染色体性優性の遺伝性疾患であることが明らかになった。

　骨髄細胞mRNAのノザンブロット解析の結果、正常個体で認められる5.1kbと4.6kbのmRNAのバンドがホモ接合型にも認められ、ホモ接合型には変異mRNAが存在することが明らかになった。また、ホモ接合型のバンド3mRNA量は正常の約30%であった。

　正常、ならびにR664X変異バンド3の各クローン(pBEBとpBEBRX)をマイクロソーム膜存在下、網状赤血球ライセート系で発現させると、それぞれ105 kDaと74 kDaの合成蛋白質がマイクロソーム膜画分に得られた。74 kDaの変異バンド3は、正常バンド3と同様に、マイクロンームのアルカリ処理後も膜画分に残存し、またトリプシン処理後には短い膜内在性部分が膜画分に検出された。また、合成RNAを注入したoocytesにおいても、これら正常、ならびに変異バンド3の合成が免疫沈降法によって確認された。

　以上の成績から、ホモ接合型個体の赤血球系細胞には変異アレル由来のmRNAが存在し、変異バンド3が正しい膜配向性で合成され、小胞体膜に挿入され得ることが明らかになった。この変異バンド3は、小胞体膜への挿入後に分解されるものと考えられた。

　エクタサイトメトリーによる解析で、ホモ接合型赤血球の膜安定性が著しく低下していることが判明した。また、ヘテロ赤血球膜は正常赤血球と同程度の変形能を保持するものの、750dyn/cm²というシアーストレス下では急速に断片化し、膜安定性の低いことが明らかになった。

　膜蛋白質含量を赤血球あたり、あるいは膜リン脂質あたりで比較すると、ホモ接合型赤血球ではバンド3、プロテイン4.2はほとんど認められず、アンキリンが50%程度に減少しているものの、ほかの膜骨格蛋白質構成はほぼ正常レベルであった。一方、ヘテロ赤血球においては、バンド3が70-80%に減少し、アンキリン、プロテイン4.2の減少は軽度(10-20%)であったが、膜骨格の主体となるスペクトリンとアクチンの有意な低下(20-30%)が生じていた。非イオン性界面活性剤による可溶化とゲル浸透クロマトグラフィーでの解析の結果、ヘテロ接合型赤血球におけるバンド3の減少は、64%が膜骨格と結合していないダイマー画分に、また36%が、膜骨格と結合しているオリゴマーに由来することが判明した。

　ホモ、ヘテロのいずれにおいても、バンド3をはじめ、減少を示した膜蛋白質のmRNAは、RT-PCR/5’-nuclease法による解析により、発現していることが判明した。また、ヘテロ接合型のバンド3mRNA総量の25-30%はR664X変異アレル由来のmRNAであった。

　pBEBとpBEBRXとから合成したRNAをoocytesに同時に注入すると、BEBRXのRNA量に依存してCl^-輸送の低下が認められた。また、網状赤血球ライセートでpBEBとpBEBRXの共存下に正常、変異バンド3を同時に合成させると、両者がヘテロ複合体を形成することが、モノクローナル抗体を用いた免疫沈降反応で明らかになった。

　以上の成績から、ホモ接合型とヘテロ接合型の両者でともに膜安定性の低下と球状赤血球化がみられるものの、その発現機序は異なると考えられた。即ち、ホモ接合型では、バンド3-アンキリン-スペクトリン間の連結が完全に失われることが、その著しい膜安定性低下の原因と考えられた。一方、ヘテロ赤血球では、合成後、異常蛋白質として認識・分解を受けるR664X変異バンド3が、正常バンド3の発現に対してドミナント・ネガティブに作用し、バンド3の部分減少が生じ、続いて他の膜骨格系蛋品質含量の低下を起こすと推測された。

　以上のことから、黒毛和種牛の遺伝性バンド3欠損症の原因遺伝子異常はR664X変異であり、変異アレル由来のmRNAは存在し、変異バンド3は小胞体膜へ挿入後分解され、バンド3欠損を呈するものと考えられた。また、赤血球球状化の発現機序はホモ接合型はヘテロ接合型とは異なっており、バンド3-アンキリン-スペクトリン間の連結が完全に失われることによると考えられた。