6〜7週齢の舒生型およびcPLA₂欠損マウスより骨髄細胞を採取し、50%WEHI-3cell-conditioned mediumと50%RPMI(10%FCS、0.1mM非必須アミノ酸、100IU/mlペニシリンおよび100g/mlストレプトマイシン含有)で4〜8週間培養した。

　培養したマスト細胞をサイトスピンによりスライドガラスに付着後、サフラニン/アルシアンブルーで染色し、光学顕微鏡により細胞内顆粒を観察した。また細胞の形態を電子顕微鏡により観察した。

FcRIおよびc-Kitの発現

　FITCラベルしたIgE抗体およびAPCラベルした抗c-Kit抗体を用い、FACSによりBMMC上のFcRIおよびc-KITの発現数を解析した。

　BMMCを抗ジニトロフェニル(DNP)IgE抗体で感作後、DNP-HSAを添加することで抗原刺激を行った。システイニルロイコトリエン(cys-LT)は10分、プロスタグランジンD₂(PGD₂)は30分、血小板活性化因子(PAF)は2分間刺激後の細胞上清をそれぞれ回収し定量した。cys-LTはエンザイムイムノアッセイにより、またPGD₂はラジオイムノアッセイにより測定した。PAFはラジオレセプター結合法により測定した。また細胞を[³H]標識したアラキドン酸でラベルし、50ng/ml DNP-HSA-で刺激後、細胞上清を回収し遊離されたアラキドン酸をシンチレーションカウンターにより測定した。

　BMMCを抗DNP IgE抗体で感作後、DNP-HSAを添加した。一定時間の後、細胞上清を回収し、ヒスタミン放出量をELISA法により定量した。

　BMMCより抽出したトータルRNAを用い、ヒスチジンデカルボキシラーゼ(HDC-)のmRNA発現量をノーザンブロット法により解析した。またHDCのタンパク質発現量を検討するため、BMMCを[³⁵S]標識ヒスチジンでラベルし、タンパク質を可溶化後、抗HDC抗体で免疫沈降した。沈降したタンパク質を電気泳動した後、放射線活性をイメージングアナライザーにより解析した。

　BMMCを抗DNP IgE抗体で感作後、DNP-HSAを添加し細胞上清を回収した。細胞上清および細胞ペレット中のベーターヘキソサミニダーゼ(-HEX)活性をそれぞれにp-ニトロフェニル-N-アセチル--D-グルコサミニドを基質として加え、37℃で1-時間反応させ、吸光度を測定することにより定量した。

　-HEXの放出量は、細胞上清および細胞ペレット中の-HEX活性をそれぞれSおよびPとして、以下の式により求めた;S/(S+P)×100。

　抗DNP IgE抗体で感作したBMMCにカルシウム感受性蛍光色素であるFura-2をロードし、DNP-HSA添加時の500nmの蛍光を340および380nmの波長で励起し測定した。

　骨髄採取後、5週間培養した細胞をサフラニン/アルシアンブルーにより染色し、光学顕微鏡により観察したところ野生型およびcPLA₂欠損マウス由来細胞ともアルシアンブルーでのみ染まり、コンドロイチン硫酸を多く含有するマスト細胞様の特徴を示した。また電子顕微鏡によりcPLA₂欠損マウス由来BMMCは形態学的に野生型と差がないことが観察された。

　FACSによるBMMC表面に発現しているレセプター数の解析では、FcRIおよびcKITの発現は野生型およびcPLA₂欠損マウス由来BMMCの両者に差はみられなかった。

　このことから培養した細胞はBMMCへと正常に分化しており、cPLA₂がマスト細胞の分化には必須ではないことが示唆された。

　アラキドン酸の遊離量、PGD₂およびcys-LT産生量はcPLA₂欠損マウス由来BMMC-において検出限界レベルにまで減少していた。PAF産生では有意な低下は見られなかったものの、cPLA₂欠損マウス由来BMMCにおいて減少する傾向にあり、cPLA₂がPAF産土に部分的に関与していることが示唆された。以上のことから、マスト細胞の活性化の即時相では、cPLA₂が生理活性脂質産土において主要な働きをしていることがわかった。

　ヒスタミン放出量は野生型およびcPLA₂欠損マウス由来BMMCともDNP刺激後約2-分で最大値に達したが、cPLA₂欠損マウス由来BMMCでは野生型に比べ有意に低下していた。しかし、細胞内のヒスタミン含量を測定したところ、cPLA₂欠損マウス由来BMMCで1513±60.32ng/10⁶ cellsと野生型2602±189.2ng/10⁶ cellsに比べ約40%の減少がみられた。その結果、正味のヒスタミン放出の割合は野生型に対しcPLA₂.欠損マウス由来BMMCで有意に上昇した。

　cPLA₂欠損マウス由来BMMCでのヒスタミン含量低下の原因を明らかにするため、ヒスタミン合成酵素であるHDCのmRNAの発現をノーザンブロッティングにより解析したところ、野生型およびcPLA₂欠損マウス由来BMMCの両者に差は見られなかった。しかし、抗HDC抗体を用いた免疫沈降法によりcPLA₂欠損マウス由来BMMCではHDCタンパク質の発現がほとんど見られず、タンパク質の安定性もしくは転写の段階において何らかの問題があると考えられた。またこのことはcPLA₂欠損マウス由来BMMCにおいてヒスタミン含有量が低下している結果と一致した。

-HEXの放出量の比較

　脱顆粒反応の指標として用いられている-HEXの抗原刺激後の放出割合を測定したところ、HDCの場合と同じくcPLA₂欠損マウス由来BMMCにおいて野生型に比べ抗原濃度依存的また時間依存的に有意に亢進していた。

　抗原刺激による細胞内カルシウム濃度の上昇はcPLA₂欠損マウス由来BMMCで野生型に比べ有意に上昇していた。また、ピークに達する時間はcPLA₂欠損マウス由来BMMCでは野生型より長かった。

　脱顆粒にはカルシウムの濃度上昇が必須とされているので、おそらくcPLA₂欠損マウス由来BMMCではカルシウム濃度の上昇が野生型よりも高いため、脱顆粒が亢進しているものと思われる。