一定乾燥重量相当の総脂質抽出液及び既知量の糖脂質標準品をプラスチック薄層プレートにスポットし、展開後、岩森らの方法に準じて免疫染色を行った。発色後のスポットの濃度は波長500nmでTLC-デンシトメーターによる測定を行った。

1,2-FTの活性測定

　酵素活性の測定は、5-50gのGA₁もしくはGM₁を基質として用い、最終濃度50mMカコジル酸-HCl(pH5.8)、20mM MnCl₂、1%Triton X-100、0.2M GDP-[1-¹⁴C]-フコースと400g蛋白質量の酵素液を加え、全量を10-100lとし、30℃1時間反応させた。

　マウス消化管組織を4%パラホルムアルデヒド入りの0.1M中性リン酸緩衝液(pH7.4)で固定後、クリオスタットを用いて4mの凍結切片を作成し、一次抗体に抗FGA₁抗体LFA-IIと抗FGM₁抗体LFM-Iを用い、二次抗体にFITC標識抗マウスIgG抗体(500倍希釈)を用い、免疫染色し、蛍光顕微鏡下に観察した。

RT-PCR法による1,2-FT遺伝子のクローニング

　報告されたラット1,2-FT遺伝子(GenBank/NCBI;AB006138)を基にデザインしたプライマーを用い、マウス小腸のcDNAをテンプレートにしてPCR反応を行った。得られた1.1kbのPCR産物はpCR2.1ベクターにサブクローニングした。同様の方法で二種類のマウス1,2-FT遺伝子についてもクローニングを行った。その結果、マウス1,2-FT遺伝子MFUT-I、MFUT-IIおよびMFUT-IIIを得ることができた。

Northernブロット法による1,2-FT遺伝子の検出

　マウス消化管各部位の全RNAをAGPC法を用いて抽出し、その30gを1.2%ホルマリンアガロースゲルで電気泳動後、ニトロセルロース膜に転写した。3種類の1,2-FTに対するプローブ、Probe-MFUT-I、Probe-MFUT-II、Probe-MFUT-IIIを用いて、Northernブロッティングを行い、BAS2000で解析した。

COS-7細胞における1,2-FT酵素の一過性発現

　MFUT-I、MFUT-II、MFUT-IIIの翻訳領域の全長を含むDNA断片を発現ベクターpcDNA3.1に組み込み、プラスミド単独、pcDNA3-MFUT-I、pcDNA3-MFUT-IIおよびpcDNA3-MFUT-IIIをリン酸カルシウム法を用い、COS-7細胞に導入した。72時間後に、細胞懸濁液を用いて1,2-FT活性を測定した。

シクロヘキシミド投与前後のICRマウス消化管における1,2-FT活性の変化

　シクロヘキシミド投与前後の無菌ICRマウス消化管各部位のGA₁、1,2-FT活性を比較したところ、無菌ICRマウス十二指腸と空腸には酵素活性は痕跡程度しか検出できないのに対し、シクロヘキシミド腹腔注射12時間後には、十二指腸で11倍、空腸で22倍の活性増加が観察された。しかし、無菌マウスの胃、回腸、盲腸および結腸には、強い1,2-FT活性が含有されており、シクロヘキシミド投与後の酵素活性は、回腸で2.2倍、盲腸で1.5倍に増加したが、胃と結腸の活性は変化しなかった。

　作成されたモノクローナル抗FGA₁と抗FGM₁抗体を用い、TLC免疫染色法により、シクロヘキシミド投与前後のマウス消化管のFGA₁とFGM₁含有量を測定した。FGM₁は無菌マウスの胃、盲腸、結腸に含有されているが、十二指腸と小腸(空腸、回腸)には全く検出できなかった。シクロヘキシミド投与48時間後のFGA₁の濃度は十二指腸で13.4倍、小腸で2.2倍に増加した。消化管部位におけるGM₁とGA₁の分布は、フコース転移活性ならびに生成物、FGM₁とFGA₁の濃度にほぼ対応していた。

ICRマウス消化管からの3種類の1,2-FT遺伝子のクローニングと塩基配列およびアミノ酸配列の比較

　RT-PCR法によって、3種類の1,2-FT遺伝子、MFUT-I、MFUT-IIおよびMFUT-IIIを単離した。MFUT-IIは初めてクローニングされた遺伝子であった。MFUT-Iは377個のアミノ酸からなる推定分子量42.4kDaのタンパク質、MFUT-IIは347個のアミノ酸からなる推定分子量39.2kDaのタンパク質、MFUT-IIIは368個のアミノ酸からなる推定分子量41.5kDaのタンパク質であることが分かった。アミノ酸配列の疎水性分析から、これらは他の糖転移酵素遺伝子と同様に2型膜タンパク質に分類される構造を持っていた。それぞれの遺伝子はヒトのH、SeおよびSec1遺伝子と相同性が高い配列を持っていた。

1,2-FT遺伝子のICRマウス各組織における発現

　MFUT-IIは成マウスの心臓、肝臓、腎臓、精巣、精巣上体、子宮、胃、小腸、盲腸、および結腸において、主に3.5kbのmRNAを発現していることが分かった。また、消化管では同時に1.6kbと7.4kbのmRNAの発現が認められた。一方、MFUT-IとMFUT-IIIはそれぞれ精巣上体、精巣のみに発現していた。

1,2-FT遺伝子のCOS-7細胞における一過性発現と酵素学的性質の検討

　発現ベクターpcDNA3.1に組み込んだ1,2-FT遺伝子をCOS-7細胞に一過性に発現させ、その活性を測定した。MFUT-IIはGA₁とGM₁ともにフコースを付加できるのに対して、MFUT-IはGA₁にのみフコースを転移でき、GM₁に対する転移活性は持たないことがわかった。また、MFUT-IIIにコードされている酵素はGA₁とGM₁いずれにもフコースを転移できなかった。

シクロヘキシミド投与前後のICRマウス消化管における1,2-FT遺伝子mRNAの変化

　Northernブロット法及びRT-PCR法により、十二指腸、空腸、回腸における1,2-FT遣伝子MFUT-IIの変化は、1,2-FT活性およびフコシルGA₁の濃度の変化に一致していた。しかし、MFUT-IとMFUT-III mRNAの発現量は変化しなかった。

　以上の結果、無菌マウスでは、小腸には1,2-FTが含まれていないものの、胃、盲腸、結腸にはすでに含有されており、小腸についてもさらに詳細な部位別の比活性を調べると、明らかな活性の勾配が形成されていることが新たに分かった。シクロヘキシミド投与によって1,2-FT活性が誘導されるのは小腸に限られ、無菌マウスの状態ですでに高い活性を持っている胃、盲腸、結腸の活性は変化しないことが明らかになった。シクロヘキシミド投与12時間後の十二指腸と空腸のGA₁基質に対するフコース転移酵素活性は11-23倍に増加しており、回腸では2倍に増加していた。組織免疫染色法によるフコシルGA₁の小腸における分布を調べたところ、FGA₁は絨毛の上部1/2に限定して分布していて、しかも、上皮細胞に発現されていることが分かった。絨毛上皮細胞は基部crypt層から上部villus層に向けて移行する途上で諸種の分化マーカーを発現し、腸上皮としての機能を獲得することが知られており、FGA₁の発現は通常飼育状態での上皮細胞の分化過程の一階段を示していると予想される。マウス消化管における糖脂質のフコシル化に関わり、また、小腸においてのみ、シクロヘキシミド投与によって転写レベルで発現が制御されている1,2-FTは、新たにクローニングしたMFUT-IIにコードされていることが分かった。