細胞内Ca²⁺は、セカンドメッセンジャーとしてさまざまな細胞機能の制御に携わっている。Ca²⁺の生理作用は、その多くがCa²⁺結合タンパク質の一つであるカルモジュリン(CaM)と複合体(Ca²⁺/CaM)を形成し、細胞内シグナル伝達系を介して発現される。すなわち、Ca²⁺/CaMは種々の酵素タンパク質に結合してその機能を調節することにより、Ca²⁺シグナルを伝達・増幅する。その中で、Ca²⁺/CaM依存性タンパク質リン酸化酵素(CaM-キナーゼ)は、Ca²⁺動員に伴い活性化される一群のタンパク質セリン/スレオニンリン酸化酵素であることから、Ca²⁺シグナル伝達系において中心的な役割を担っているものと考えられる。これまでに、多くの種類のCaM-キナーゼ(CaM-K)が哺乳類から単離、同定され、筋収縮や神経伝達物質の放出、遺伝子発現を含めてCa²⁺シグナルによる生理機能の制御に関与することが報告されてきた。CaM-KI、CaM-KII、及びCaM-KIVは、in vitroで種々のタンパク質やペプチドをリン酸化することから、多機能性リン酸化酵素として認識されている。また、これらの酵素はそれ自身、あるいは別のリン酸化酵素によってその活性がCa²⁺/CaM依存的に調節されている。CaM-KIIが自己リン酸化によりCa²⁺/CaM非依存性のリン酸化酵素に変換されるのに対して、CaM-KIとCaM-KIVの両酵素は、触媒ドメイン内の「活性化ループ」中に存在するスレオニン残基(Thr)(哺乳類CaM-KIではThr¹⁷⁷、哺乳類CaM-KIVではThr¹⁹⁶)がCaM-キナーゼキナーゼ(CaM-KK)によるリン酸化を受けて、その触媒能を増大させることが近年明らかにされた。このように、CaM-KI、CaM-KIVは細胞内Ca²⁺濃度の上昇に応答して上流のCaM-KKによるリン酸化を通じて活性化され、さらに下流へシグナルを伝達するCaM-キナーゼカスケードを構成している。一方、CaM-KKはPKB(protein kinase B)をリン酸化して(Thr³⁰⁸)活性化することにより、アポトーシスの制御にも関与することが報告された。このように、CaM-KKはCaM-キナーゼに限らず他のリン酸化酵素を介して数多くの細胞機能を制御することが示唆された。しかしながら、これまでのCaM-キナーゼカスケードに関する研究は、哺乳類から単離されたCaM-キナーゼやCaM-KKの活性制御機構を中心にin vitro、及び培養細胞において進められてきたために、CaM-キナーぜカスケードの生理的役割や標的分子についてはほとんど明らかにされていない。遺伝子の生理機能を理解するには分子、細胞レベルだけでなく、個体レベルでの解析も必要であるので、本研究ではセンチュウCaenorhabditis elegansを用いて、CaM-キナーゼカスケードの制御機構とそれを介して調節される細胞機能の解明を目的とした。そこで、私はまずセンチュウにおけるCaM-キナーぜカスケードを構成するCaM-KKとCaM-キナーぜを単離し、それらの一次構造と触媒能、並びに活性制御との相関を含めて解析を行った。さらにこのカスケードの標的分子としてcAMP response element(CRE)-binding protein(CREB)をセンチュウから単離し、CaM-キナーぜカスケードによるCREBを介した転写の調節機構を検証した。

　まず、哺乳類CaM-KKとの相同性をもとに、逆転写酵素を用いたPCRによりセンチュウから単離したcDNAは、ヌクレオチド配列を決定した結果、357アミノ酸残基をコードしていた。その組み換えタンパク質はCa²⁺存在下でCaMと結合し、in vitroで哺乳類CaM-KIVをCa²⁺/CaM依存的に活性化したことから、この分子はセンチュウCaM-KK(CeCaM-KK)であることが推定された。また、CeCaM-KKには触媒ドメイン中にアルギニン/プロリン残基に富む領域(RP-ドメイン)が挿入されていることを見い出した。この領域はCaM-キナーゼ群には見られないが、哺乳類CaM-KKには認められ、種を越えて保存されていることからCaM-KK機能に特有の役割を担うものと考えられた。そこで、RP-ドメインを欠失させた哺乳類CaM-KKの変異体を作製し、その基質であるCaM-KI、CaM-KIV、及びPKBに対するリン酸化能と活性化能を調べた。その結果、変異型CaM-KKはCaM-KI、CaM-KIVをリン酸化、活性化することができなかった。一方、変異型CaM-KKはPKBに対して野生型と同様のリン酸化能、活性化能を示した。この結果から、RP-ドメインはCaM-KKによるCaM-キナーぜ基質の特異的な認識に必須であることが示唆された。したがって、CeCaM-KKはRP-ドメインを有していて、実際に哺乳類CaM-KIVを活性化したことから、センチュウにもCaM-KKを介したシグナル伝達経路があり、その標的基質の一つとしてCaM-キナーゼが存在し、タンパク質リン酸化カスケードを構成している可能性が示された。

　次に、私はセンチュウからCaM-KKの基質となるCaM-キナーゼを単離し、その機能解析を行った。逆転写酵素を用いたPCRとハイブリダイゼーションによるスクリーニングによりcDNAをクローニングし、ヌクレオチド配列を決定した。その結果、CDNAは348アミノ酸残基をコードしていて、アミノ酸レベルで哺乳類CaM-KIと約60%の相同性を有したことから、センチュウCaM-KI(CeCaM-KI)と名付けた。そのcDNAをCOS-7細胞にて発現させた組み換えタンパク質は、Ca²⁺存在下でCaMと結合し、SDS-PAGE上で約40kDaの移動度を示した。また、センチュウの内在性CeCaM-KIを検出するために、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質(GST-CeCaM-KI)に対する抗血清をウサギにて作製した。これを用いて、センチュウの細胞抽出液をCaMカラムに通して部分精製した画分に対するウェスタンブロティングを行った結果、抗血清に反応する約40kDaのCaM結合タンパク質が見い出された。これはアミノ酸配列をもとに算出された分子量39,066に一致し、組み換えタンパク質とSDS-PAGE上で同じ移動度を示したことから、センチュウ内在性のCeCaM-KIを検出したものと推定された。これらの結果は、クローニングしたcDNAがCeCaM-KIの全長をコードしていることを示唆した。CeCaM-KIのリン酸化酵素活性については、GST-CeCaM-KIを用いて基質の合成ペプチドへのリンの取り込みをin vitroにて測定した。その結果、GST-CeCaM-KIはCa²⁺/CaM依存的にリン酸化酵素活性を示したが、COS-7細胞にて発現させCaMカラムを用いて部分精製したCeCaM-KKによりThr¹⁷⁹がリン酸化を受けると、その活性はCa²⁺/CaM存在下で約10倍増大された。CeCaM-KIの活性化は、その変異体を用いた解析により、カルポキシル末端に存在する自己抑制領域とCaM結合領域からなる調節ドメインへのCaMの結合とCeCaM-KKによるThr¹⁷⁹のリン酸化という二重の制御を受けていることが推察された。また、CeCaM-KKにより活性化されたCeCaM-KIと活性化されていないCeCaM-KIとの酵素活性の違いについて基質の合成ペプチドとATPに対する反応速度論的解析を行うと、両酵素間でペプチド基質に対するVmax、及びATPに対するKm、Vmaxはほぼ同じ値を示したのに対して、ペプチド基質に対するKm値は活性化されていない酵素に比べて活性化された酵素で約30倍減少した。したがって、CeCaM-KKによるThr¹⁷⁹のリン酸化はCeCaM-KIと基質との親和性を増大させることによって、その触媒効率を増大させるものと考えられた。以上の結果は、CeCaM-KKによるThr¹⁷⁹のCa²⁺/CaM依存的リン酸化がCeCaM-KIの酵素活性を調節するというカスケードの存在を明らかにした。

　さらに、CaM-キナーゼカスケードが調節する細胞機能を検討するために、CeCaM-KIとCeCaM-KKの細胞内局在を調べた。緑色蛍光タンパク質との融合タンパク質を各々COS-7細胞にて一過性発現させ蛍光顕微鏡下で観察すると、CeCaM-KIは核を中心に局在した。これは、高い相同性を示すラットCaM-KIが細胞質に局在することと大きく異なる性質である。興味深いことに、CeCaM-KIのアミノ末端にあるリジン⁵-アルギニン⁶-アルギニン⁷を含む6アミノ酸残基(2-7)との相同配列がラットCaM-KIには認められない上に、この領域を欠失させたCeCaM-KI変異体が核に局在できなかったことから、そのアミノ酸残基の中に核移行シグナルの存在が示唆された。一方、CeCaM-KKは核と細胞質の両方に存在した。さらに、CeCaM-KIの核局在については、センチュウ個体を用いた解析でも認められた。CeCaM-KKとCeCaM-KIが核に存在することは、これまで哺乳類CaM-KK/CaM-KIVカスケードの関与が示唆されてきたように、このカスケードの転写制御への関与が考えられた。CeCaM-MとCeCaM-KKを共発現させたCOS-7細胞では、Ca²⁺刺激によりCREBのリン酸化とCREに依存した転写の活性化を顕著に誘導することがウエスタンブロッティング法とレポーターアッセイ法を用いて示された。したがって、センチュウCaM-KK/CaM-KIカスケードはCREBのリン酸化を介して転写を活性化することが示唆された。そこで、私はセンチュウからCREB(CeCREB)のcDNAをクローニングし、ヌクレオチド配列を決定した。cDNAは328アミノ酸残基をコードしていて、CeCaM-KIによるリン酸化部位の近傍と塩基性アミノ酸に富む領域、ロイシンジッパーモチーフのアミノ酸配列が哺乳類CREBと高い相同性を有していた。次に、センチュウCaM-キナーゼカスケードによるCeCREBを介した転写の活性化についてin vitro、in vivoでの解析を行った。その結果、CaM-キナーゼカスケードはCeCREB(54番目のセリン残基)のリン酸化を増強し、これに応じてCa²⁺刺激によりCeCREBを介した転写活性を増大させた。また、CeCaM-KIの恒常的活性化型を導入したトランスジェニックセンチュウでは、内在性CeCREBのリン酸化が有意に誘導された。これらの結果は、CeCREBがセンチュウCaM-キナーゼカスケードの生理的な標的分子であることを示唆すると同時に、このカスケードがCeCREBのリン酸化を介して転写を活性化することを示した。以上のように、CaM-キナーぜカスケードは哺乳類だけでなくセンチュウにおいても保存されていて、CeCaM-KK→CeCaM-KI→CeCREBというシグナル伝達経路がCa²⁺依存性の転写制御に機能することが推察された。現在、私はCaM-キナーゼカスケードの生理的役割を検討するために、センチュウを用いてこれらの発現パターンの解析、遺伝子破壊センチュウの作製と解析を進めている。

　本研究は、Ca²⁺をセカンドメッセンジャーとする細胞シグナル伝達系において重要な役割を演じていると考えられるCa²⁺/カルモジュリン依存性リン酸化酵素(CaM-K)カスケードの生物学的意義を明らかにするために、センチュウCaenorhabditis elegansをモデル動物として用い、CaM-Kカスケードの機能解析を分子、細胞、個体レベルで試みたものであり、下記の結果を得ている。

　1.センチュウにおいて、CaM-Kカスケードを構成するCaM-Kとその上流の活性化因子CaM-K kinase(CaM-KK)をコードするcDNAを、既存の哺乳類のCaM-K、CaM-KKとの相同性をもとにそれぞれクローニングした。それらのヌクレオチド配列を決定したところ、センチュウCaM-KK(CeCaM-KK)には、哺乳類CaM-KKと同様に、触媒ドメイン中にアルギニン、プロリンの両残基に富む領域(RP-ドメイン)が挿入されていることが見い出された。一方、センチュウCaM-K(CeCaM-K)は、アミノ酸レベルで哺乳類CaM-KIと約60%の相同性を有したことから、CeCaM-KIと名付けた。哺乳類のCaM-KK、CaM-Kには、異なる遺伝子がコードする複数のクローンが存在するのに対して、センチュウにはゲノムDNAのデータベースを探したところ、本研究で得られた1種類ずつのCaM-KK、CaM-Kしか存在していないことが示された。また、両者のcDNAをCOS-7細胞にて発現させた組み換えタンパク質は、Ca²⁺存在下でカルモジュリン(CaM)と結合することが示された。さらに、センチュウ内在性のCeCaM-KIは、それに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出され、その組み換えタンパク質と同じ移動度を呈示したことから、クローニングしたcDNAは全長をコードしていることが示唆された。

　2.CaM-KKは、RP-ドメインが種を超えて保存されていることから、その機能に特有の役割を担うことが考えられたが、全く明らかにされていなかった。そこで、RP-ドメインを欠失させた哺乳類CaM-KKの変異体を用い、CaM-KI、CaM-KIV、及びPKBに対するリン酸化能、活性化能をin vitroにて調べた。その結果、変異型CaM-KKはCaM-KI、CaM-KIVをリン酸化、活性化することができなかった。一方、変異型CaM-KKはPKBに対して野生型と同様のリン酸化能、活性化能を示した。このことから、RP-ドメインはCaM-KKによるCaM-K基質の特異的な認識に必須であることが示された。したがって、CeCaM-KKがRP-ドメインを有していて、哺乳類CaM-KIVをリン酸化、活性化したことから、センチュウにおいて、CeCaM-KKを介したシグナル伝達系とその基質としてCaM-Kが存在すること示唆された。

　3.CeCaM-KIのリン酸化酵素活性は、大腸菌にて発現させ、精製したGST-CeCaM-KI融合タンパク質を用い、in vitroにて測定した。その結果、GST-CeCaM-KIはCa²⁺/CaM依存的にリン酸化酵素活性を示したが、COS-7細胞にて発現させCaMカラムを用い部分精製したCeCaM-KKによりリン酸化を受けると、その活性はCa²⁺/CaM存在下で約10倍増大した。また、CeCaM-KIの変異体を用いた解析により、Thr¹⁷⁹がCeCaM-KKによるリン酸化部位であること、296番目のアミノ酸残基からカルボキシル末端側にCaM結合領域が存在していること、並びにCeCaM-KKの活性発現にもCa²⁺/CaMを必要とすることが示された。さらに、CeCaM-KKにより活性化されたCeCaM-KIと活性化されていないCeCaM-KIとの酵素活性の違いについて、基質の合成ペプチドとATPに対する反応速度論的解析を行ったところ、CeCaM-KIの活性増大はCeCaM-KKによるリン酸化が基質との親和性を増大させることにより引き起されることが示された。

　4.CeCaM-KKとCeCaM-KIの細胞内局在を調べるために、それぞれのGFP融合タンパク質をCOS-7細胞に発現させ、蛍光顕微鏡下で観察した。その結果、CeCaM-KKは核と細胞質の両方に存在した。一方、CeCaM-KIは、高い相同性を示したラットCaM-KIが細胞質に存在することと異なり、核に局在することが示された。CeCaM-KIのアミノ末端に存在するリジン⁵-アルギニン⁶-アルギニン⁷を含む6アミノ酸残基を欠失させた変異体では、核に局在できなかったことから、このアミノ酸残基の中に核移行シグナルの存在が示唆された。さらに、CeCaM-KIの核局在についてはセンチュウ個体を用いた解析でも認められた。これらの結果は、センチュウにおいてCaM-Kカスケードが核での細胞機能に関与していることを示唆した。

　5.哺乳類ではCaM-KIVが核に局在し、転写因子のcAMP response element(CRE)-binding protein(CREB)をリン酸化することが既に報告されている。そこで、センチュウにおけるCaM-Kカスケードが核に存在することからCREBをリン酸化し、転写を制御することが考えられた。しかし、センチュウでは樹立された細胞株や確立された初代培養の方法、あるいは転写活性の測定系などがないのでCOS-7細胞を用いた。CeCaM-KKとCeCaM-KIを共発現させたCOS-7細胞では、Ca²⁺刺激により内在性CREBのリン酸化とCREに依存した転写の活性化が顕著に誘導されることがウエスタンブロティングとレポーターアッセイにより示された。

　6.センチュウにおいてCaM-KカスケードはCREBのリン酸化を介して転写を調節することが示唆されたので、センチュウ由来のCREB(CeCREB)のcDNAを既存の哺乳類、ハエなどのクローンとの相同性をもとにクローニングした。ヌクレオチド配列から予測されるアミノ酸配列では、CeCaM-KIによるリン酸化部位のSer⁵⁴近傍、カルボキシル末端側の塩基性アミノ酸残基に富む領域、及びロイシンジッパーモチーフが他の種のCREBと高い相同性を有していることが示された。

　7.センチュウにおいて、CeCREBがCaM-Kカスケードの標的として機能するかどうかを明らかにするために、CaM-KカスケードによるCeCREBのリン酸化とそれを介した転写の活性化についてin vitro、in vivoにて解析した。その結果、CaM-KカスケードはCeCREBのSer⁵⁴のリン酸化を増強し、これに応じてCa²⁺刺激によりCeCREBを介した転写活性を増大させることが示された。また、恒常的活性化型CeCaM-KIのトランスジェニックセンチュウでは、内在性CeCREBのリン酸化が有意に誘導された。これらの結果は、センチュウにおいてCeCREBがCaM-Kカスケードの生理的な標的分子であることと同時に、このカスケードがCeCREBのリン酸化を介して転写を調節し得ることを示唆した。したがって、CaM-Kカスケードは哺乳類だけでなくセンチュウにおいても保存されていて、CeCaM-KK→CeCaM-KI→CeCREBというシグナル伝達経路がCa²⁺依存性の転写制御に機能することが推察された。

　以上、本研究はセンチュウにおいて、CaM-Kカスケードの生化学的解析、遺伝学的解析から、その存在と機能を明らかにした。本論文は、これまで未知に等しかった、Ca²⁺シグナル伝達系で中心的に働くと考えられる、CaM-Kカスケードの生物学的意義の解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。