X染色体連鎖免疫不全(X-linked immunodeficiency:Xid)マウスは細胞内チロシンキナーゼであるブルトン型チロシンキナーゼ(Btk)のPH領域に1つのアミノ酸変異(Arg28からCys)を有し、B細胞分化異常に起因する広範なB細胞免疫不全を示す。共同研究者らは、Xidマウスの腹腔におけるインターロイキン5レセプター(IL-5R)陽性B細胞数はB-1細胞の欠損に一致して減少していること、IL-5R陽性B細胞も正常マウスのIL-5R陽性B細胞に比べてIL-5応答性が著しく低いこと、しかしながらXidマウスにおいては好酸球のIL-5に対する応答性はin vivo、in vitroともに正常マウスと変化がないことなどを報告した。XidマウスのB細胞はIL-5RのほかにB細胞抗原レセプター(B cell antigen receptor:BCR)、インターロイキン10レセプター(IL-10R)、高親和性Fc レセプター(FcRI)およびCD38からの刺激に対する応答性が低下していることが報告されている。このようにB細胞の増殖、分化においてBtkは主要な役割を果たすことが明らかとなってきた。 B細胞の分化増殖に必須であるBtkが細胞内シグナル伝達経路にどのように関与しているか、またBtkはBtk/Tecファミリーを形成しているが、これらのキナーゼが同じような形で関与するような細胞内シグナル伝達経路のBtk/Tecファミリーに共通で特有なpathwayが存在するのかどうかを明らかにすることはきわめて重要である。これらの観点に立脚し、共同研究者らによるXidマウスB細胞のIL-5低応答性の解析結果を踏まえ、Xidマウスにおいて変異(Arg28からCys)の見られるBtkのPH領域に着目し、PH領域と相互作用する分子の同定を行った。 IL-5刺激により増殖、Btk活性が亢進する早期B細胞株Y16由来のcDNAライブラリーを用いた発現クローニング法により3つのクローンを同定した。これらのうちの1つのクローンはチロシンキナーゼリン酸化モチーフを持つことが分かり、Btkの基質となることが期待された。そこでこのクローンの全長cDNAをプラークハイブリダイゼーションおよびRACE法により単離し、解析を行った。 cDNAは約1,900bpよりなり、547アミノ酸をコードすることが予測された。cDNAを大腸菌で発現させたタンパク質の会合実験により、Btkと会合することが確認されたので、この分子をBAM11(Btk Associated Molecule-11)と呼ぶことにした。ノーザンブロッティングの結果、この遺伝子の転写物はマウスの多くの組織(脳・心臓・胸腺・脾臓・腎臓・肝臓・リンパ節・骨髄・小腸・筋肉・肺)に存在していることが分かった。遺伝子配列検索により、BAM11はヒト白血病細胞での11q23のMLL/ALL-1/HRXの転座における相手染色体遺伝子の1つとして発見されたLTG19/ENLとアミノ酸レベルで89%の相同性を持つことが明らかになった。 まずBtkとBAM11とのin vivoでの会合を、BAM11を発現させたY16細胞での免疫沈降実験により確認した。このときBtkと同様Btk/Tecファミリーの1つであるTecとの会合を調べたところ会合が見られなかったことから、BAM11とBtkとの会合はある程度の特異性を持つことが分かった。BAM11のBtkとの会合部位を同定するためGST融合タンパク質として部分欠失BAM11を構築して会合を調べたところ、BAM11の240番目から256番目のアミノ酸がBtkとの会合に重要であることが明らかとなった。 Btkと会合することが確認されたBAM11は、配列上3つの予想されるチロシンリン酸化モチーフを持つ。そこでIL-5刺激によるBtk活性の上昇とIL-5依存的増殖応答性を示すY16細胞を用いて、IL-5刺激によるBAM11のチロシンリン酸化について解析したところ、IL-5刺激後Btkのチロシンリン酸化は確認されたが、BAM11のチロシンリン酸化は観察されなかった。したがってBAM11はBtkの基質ではないと考えられた。 早期B細胞株Y16はIL-5刺激依存的に増殖が誘導されるが、そのとき同時にBtkの活性が上昇することを共同研究者らは報告した。この系を用いてBtkを介するシグナル伝達系におけるBAM11の機能を明らかにするために、BAM11の全長および部分欠失BAM11をIL-5依存性細胞株Y16およびIL-2依存性細胞株CTLL-2に発現させて、それぞれIL-5、IL-2に対する増殖応答性を調べた。その結果240-368番目のアミノ酸(BAM11(aa240-368))を発現させたY16細胞株でIL-5依存性増殖の抑制が認められた。しかし同じ部分欠失BAM11を発現させたCTLL-2細胞株でのIL-2依存性増殖には影響が見られなかった。この結果はBAM11(aa240-368)が増殖の抑制に働くことと同時に、BAM11はIL-2RではなくIL-5Rを介したシグナル伝達に関与していることを示している。 次にBtkと会合するBAM11が、Btk活性にどのように関与しているかを調べるために in vitroキナーゼ試験を行ったところ、IL-5依存性の増殖応答を抑制したBAM11(aa240-368)は濃度依存的にBtkのキナーゼ活性を抑制することが分かった。このことからBAM11(aa240-368)がBtkのキナーゼ活性を抑制し、その結果としてY16細胞のIL-5増殖応答性を低下させることが示唆された。 Btkはおもに細胞質に存在することが知られている。一方BAM11と高い相同性を持つヒトLTG19/ENLは核移行シグナルを持ち、主として核に存在することが示唆されている。そこでBtkとBAM11の会合様式を検索するために細胞の分画とBtk-GFP融合タンパク質の遺伝子導入実験でBtkの細胞内での局在を調べたところ、Btkの一部が核に存在することが観察された。またBAM11もY16細胞にBAM11を過剰発現させた系で核、細胞質ともに存在することが分かった。次にBtkの核への局在とBtkの活性化の関係を調べるために、細胞にBtkとともに全長および部分欠失BAM11を導入し、Btkの局在を観察したところ、Btkのみを導入した場合と比較し変化は見られなかった。Btkの核への局在は、Btkのキナーゼ活性を抑制するBAM11(aa240-368)との共発現でも影響が見られなかったことから、キナーゼ活性を持たない変異Btk(K430R)を導入し局在を調べたところ、Btk(K430R)は野生型Btkと同様の核局在パターンを示した。以上の結果がら、Btkの核局在はBtkのキナーゼ活性に非依存的であることが示唆された。 |