完全人工心臓を装着したヤギに使用し、414日目に交換したPU製人工弁に沈着した石灰沈着物の解析を透過型電子顕微鏡顕(HR-TEM)と電子線回折を用いて行った。

　PUに対して初めて交互浸漬法を用い、PUの化学的性質としてPUに含まれるシリコンに着目し、シリコンの石灰沈着に対する影響を反映しうるかを検討した。シリコンを多く含むPUとしてK-IIIを用い、シリコンを含まないPUとしてPellethane(R)2363-80AEとPellethane(R)2363-55DEを用いた。Siの分析には、X線光電子分光法(XPS)を用いた。沈着物量は真空乾燥重量より計算し、沈着物の性状は走査型電子顕微鏡(SEM)、X-ray microanalyzer(EDX)を用いて分析した。

　血漿タンパクの石灰沈着に対する影響を同様に評価した。血漿タンパクとして、Bovine serum albumin(BSA)、-globulin、fibrinogenを用いた。タンパクをPUフイルムに吸着した後、交互浸漬法により石灰沈着をおこなった。石灰沈着物は、ラマン光分析、薄膜X線回折、SEM、EDXを用いて観察した。カルシウム沈着量はorthocresolphtaleincomplexone法を用いて測定し、タンパク吸着量はmicro protein assay kitを用いて比色法により測定した。

　EDXの分析により沈着物はリン酸カルシウムであることが判明した。Ca/P比は2.2であった。PU薄膜上の沈着物の部位は引っ張り応力のかかる部位と一致していると考えられた。

　試料のHR-TEMでの5万倍画像には直径数m程度の黒色と白色の粒子が認められ、黒色部と白色部を制限視野電子線回折により分析したところ、黒色部ではリング状の回折パターンがみられ、白色部では完全なハローパターンがみられた。これより黒色部では微量の結晶が存在するが、白色部では完全な非晶質な領域であると判断された。黒色部の結晶を同定するために、回折リングより面間隔を算出し、結晶データベースであるJoint Committee on Powder Diffraction Standards(JCPDS)カードで検索した結果HApが含まれると判断した。さらに、黒色部の20万倍拡大像より、各粒子は長さ数10nm、輻数nm程度の線維状(fibril状)の粒子の集合体であった。線維状の微細な粒子の向きはランダムであり、これらの粒子以外に特徴的な粒子像はみられなかった。HApは六方晶系に属すが、HAp以外のアパタイトは室温で結晶構造の対称性が低く単斜晶であり比較的容易に双晶を示すことが予測されるが、画像上でそのような形態は認められなかった。以上の回折リングおよび形態的な分析より、黒色物質はHAPであると判断された。

　交互浸漬したPU上にはEDX分析によりリン酸カルシウムの形成が確認された。形成量の増加と交互浸漬回数との関連をみると、K-IIIでの形成量は4回以降で直線的に増加した。シリコンを多く含むK-IIIの表面には、10回の交互浸漬後、約20g/cm²lの石灰沈着が形成され、シリコンを含まないPellethane (R)2363-80AEやPellethane(R)2363-55DEよりも多かった。

　EDXによる分析から沈着物はリン酸カルシウムであり、Ca/P比は1.5〜1.7でアパタイトであると判断された。交互浸漬した後のPU上のカルシウム量は、タンパクを吸着させたPUの方がタンパクを吸着させないPUより有意に多かった。fibrinogenを吸着させたPU上でのアパタイト形成量はいずれのPUでも多い傾向にあった。fibrinogenを吸着させ10回交互浸漬を行ったK-III上のアパタイトにはラマン光分析でHap由来のOH基のOH伸縮振動のピークが3570cm^-1付近に認められた。fibrinogenを吸着させた後、200回交互浸漬したK-III上には、薄膜X線回折装置(TH-XRD)を用いた解析により回折像のパターンがHApの結晶格子面の002、211,112,300,202,310面に一致しており微量で結晶性は低いがHApが形成されていることが判明した。走査型電子顕微鏡(SEM)を用いた表面の観察で、アパタイトの形態は吸着したタンパクの種類と基材とで明らかに異なっていた。例えば、fibrinogenを吸着したK-III上には小さな球状の集合物がみられたが、fibrinogenを吸着させたPellethane(R)2363薄膜上には小さな金平糖形の集合体が観察された。

　長期間人工心臓ポンプに用いた人工弁上の石灰沈着物にHApが含まれていることが判明し、これは生体弁や心血管埋入物の石灰沈着物にHApが含まれている報告と一致すると考えられた。EDXの結果、Ca/P比は2.2であり沈着物の全てがHApであるとは考えにくく、この理由としてEDX分析の際の散乱線による影響や、MgやFeなどの微量金属やCO₃^2-がカルシウムに一部置換している可能性が考えられた。生体弁や心血管埋入物の石灰沈着物には不活化された細胞や細胞の破片、細胞内の小胞様の構造物などが指摘され、ALPや他のフォスファターゼの作用によりリン酸カルシウムの生成を促進すると考えられている。さらに、生体内の一部に人工循環系を代用した特殊な条件下でのアパタイト沈着の影響もあると考えられ、病態生理的な要因も考慮する必要があが、今回サンプルとなった成ヤギでは臓器の変性が少なく、術後経過からも長期生存したヤギは循環動態や生化学検査などの生理的な長期安定性は保たれており石灰沈着との関連は不詳であった。一方、化学的要因として、リンとカルシウムとの核形成と成長という要因もあげられ、特に血液中ではイオンが吸着する材料や生体高分子の性状、体液のイオン強度が影響をしてくると考えられる。石灰沈着物の組成や結晶構造については、生体弁や人工血管についての報告はみられるが、人工弁や人工心臓での報告がない。今回、PU弁上の石灰沈着物にHApが含まれていたことは新しい知見で意義があると考えられた。

　アパタイト形成量の増加と交互浸漬回数との関連をみると、K-IIIでは、交互浸潰4回以降に形成量は浸交互潰回数の増加とともに直線的に増加した。これは、交互浸漬の1〜2回でK-III表面上にカルシウムとリンイオンによるアパタイトの核形成を生じ、さらにアパタイト層が成長していくためと考えられた。Pellethane(R)2363-55DEにおいては、6回の交互浸漬以降に増加が見られたがK-IIIと比較して少なかった。これは、カルシウムイオンとリンイオンの吸着がPellethane(R)2363-55DE上では少ないためと考えられる。一方、Pellethane(R)2363-80AEでは、アパタイトの形成がほとんど見られず、交互浸漬4回以降は、K-IIIととの間に有意差があり、Pellethane(R)2363-80AE上ではカルシウムやリンイオンの吸着が起こりにくいことを示唆する。沈着物形成にはカルシウムやリンイオンと直接接しうるタンパクやリン脂質が関与すると考えられているが、これらの生体分子のあるなしに関わらず生体材料表面とカルシウムやリンの溶液との接触によりアパタイトの形成が化学的にコントロールされるとも考えられている。化学的要因としてカルボキシル基やリン酸基がアパタイトの形成に促進的に働く報告があり、表面上の陰荷電がアパタイトの形成に促進的に働くことを示唆している。また、最近PDMSで修飾をしたセラミックスが効果的にアパタイトを形成したという報告もあり、以上の結果よりPU内のシリコンは、石灰沈着物の形成に寄与している可能性があると考えられた。交互浸漬法を用いることにより、基材自体の特性に応じたアパタイト形成を反映しうると考えられた。

　アパタイト形成量と交互浸漬回数との関連は3.2と類似していた。これは、初期の段階(1回から4回)でカルシウムとリンイオンがPU上のタンパクに吸着し核形成が生じ、引き続いて成長が起こるためだと考えられた。タンパク溶液に浸漬したサンプルで有意にアパタイトの形成量が大きく、アパタイト形成はタンパクにより促進されたと考えられた。これは、タンパクが基材に吸着した際、タンパクの構造に変化が生じ、カルシウムやリンイオンの濃度が核形成のエリアとなる部位で高くなるため核形成が促進されると考えられる。タンパクの構造の変化がアパタイトの核形成に重要な役割を演じていると考られているが、交互浸漬の系においてもin vitroでの再現が可能だと考えられた。その他の要因として、膜の表面電位やタンパクの等電点なども関連すると考えられる。SEMで観察された形態の相違は、タンパクの構造の変化や基材それ自体の物理化学特性に起因するものと考えられ、このモデルにてタンパクの影響を反映しうることが示唆された。

　交互浸漬法が生体内でのアパタイト沈着と共通すると考えられる点は、アパタイトの核形成と成長の過程を再現している点である。交互浸漬法により形成されるアパタイトがHApである点も、長期間の生体内埋人後の埋入物にHApが形成されるの点と類似している。一方、異なる点として、交互浸漬法は従来の方法や生体内でのアパタイト形成に比べて短時間でアパタイトが形成できる点である。これは、溶液中のカルシウムやリン濃度が、熱力学的に安定なHApが形成できやすいように濃度比を調整しているためであるカルシウムイオンとリンイオンを同一溶液に混合していないため、イオンが単体で材料に容易に吸着ないしは進入し、核形成が生じやすくアパタイトを形成しやすい理由と考えられる。この溶液中には、通常体液中に含まれるマグネシウムや鉄などの微量元素は含まれておらず、ナトリウムやクロール、カリウムといった電解質の組成も生理的条件とは異なっている。また、細胞成分や酵素などの生理活性物質の混入がなく、このモデルの結果が生体内での複雑な石灰沈着の機序に直接的には適用できるものではないという限界をふまえることが重要である。しかし、体内での材料表面のアパタイト形成に何らかの材料自体の化学組成、物理的性質の影響があることも否定できず、単純化したモデルで得られた結果が今後のアパタイト合成メカニズムの解明に少しでも役に立つことを期待され、アパタイト形成の評価法の一つの手段として短期間で石灰沈着の生じる加速系として用いることは意味のあることだと考える。今回、未だなされていなかった交互浸漬モデルでのポリウレタンに対する石灰沈着の基礎データを初めてとることが出来たことは意義があると考えられた。