対象は1999年8月までに東京大学医学部附属病院神経内科および国内の医療機関で脊髄小脳変性症と臨床診断された日本人患者334家系395名である。患者の末梢血からDNAを抽出し、遺伝子解析を行った。常染色体性優性遺伝形式をとる6疾患:MJD、脊髄小脳失調症1型(spinocerebellar ataxia type 1:SCA1、以下同様)、脊髄小脳失調症2型(SCA2)、脊髄小脳失調症6型(SCA6)、脊髄小脳失調症7型(SCA7)、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(dentatorubral pallidoluysian atrophy:DRPLA)の原因遺伝子を解析した。何れも患者では遺伝子内のCAGリピートが異常伸長していることが明らかとなっている。方法は、疾患遺伝子ごとに特異的な蛍光プライマーを作成し、遺伝子内のCAGリピート領域をPCR法により増幅後、蛍光自動シークエンサーを用い、GENESCAN(ABI)で解析した。結果は、常染色体性優性遺伝性脊髄小脳失調症203家系262名のうち、MJDが60家系(29.6%)と最も頻度が高く、次いでDRPLAが45家系(22.2%)、SCA6が25家系(12.3%)と多く、SCA2は8家系(3.9%)、SCA1は2家系(1.0%)と少数であった。SCA7は、解析した日本人家系内ではみられなかった。上記6疾患に該当しない常染色体性優性遺伝性脊髄小脳失調症の家系が63家系(31.0%)存在した。遺伝子解析の過程で、MJDのCAGリピート数が60回のホモ接合体を1例、多系統萎縮症患者で正常とMJDの中間サイズ(CAGリピート数48回)の対立遺伝子(intermediate allele)を持つ症例を1例経験した。

　自験例のMJD家系の解析からCAGリピート数と発症年齢は負の相関関係(r＝-0.84)を示し、病型(Coutinho and Andrade,1978)によりCAGリピート数と発症年齢の分布は異なるという分子遺伝学的特徴を確認した。I型、II型、III型の順に発症年齢が低く、大きなCAGリピート数に分布しており、統計学的にも上記の病型群間で有意差を認めた(pく0.001)。

　MJDはポルトガル領アゾレス諸島から北米に移民した家系の報告から臨床的に疾患単位として認められた疾患である。その後、ポルトガル系以外の民族集団にもMJDが存在することが明らかとなった。本邦でも患者数は多く、上述のように日本人遺伝性脊髄小脳失調症の中では約3割を占めると推定される。MJDは様々な民族集団に認められるが、突然変異の起源を検討していく手がかりとして、遺伝子内多型のハプロタイプ解析を行った。MJD遺伝子内には、CAGリピート以外に、926塩基、987塩基における一塩基置換多型[CA⁹²⁶(Gln)/CA(Gln)、⁹⁸⁷GG(Arg)/GG(Gly)]が報告されている。遺伝子構造解析の過程で、新たに3箇所の多型:GT⁵²⁷(Val)/GT(Val)、⁶⁶⁹TG(Met)/TG(Val)、TA¹¹¹⁸(Stop)/TA(Tyr)を同定した。TA¹¹¹⁸/TA多型は一塩基置換により終止コドンがチロシンに変化し、open reading frameが16アミノ酸長くなるものであった。本研究では、日本人集団において、4箇所(527塩基、669塩基、987塩基、1118塩基)の一塩基置換多型とCAGリピート数との関係について検討した。対象は、正常対照者66名、MJD患者53家系64名、中間型1名である。527塩基、669塩基、1118塩基の多型ついては、SSCP法を用いて多型を検出した。987塩基と1118塩基の多型に関しては、アレル特異的なプライマーを作成し、CAGリピートを含むゲノムPCRを行い、蛍光自動シークエンサーにて解析した。4箇所の一塩基置換多型とCAGリピート数の間には強い連鎖不平衡が認められ(p<0.001)、日本人集団では(⁵²⁷T-⁶⁶⁹A)-⁹⁸⁷C-¹¹¹⁸A、(⁵²⁷C-⁶⁶⁹G)-⁹⁸⁷G-¹¹¹⁸Cの2種類のハプロタイプのみと推定された。遺伝子頻度は(⁵²⁷T-⁶⁶⁹A)-⁹⁸⁷C-¹¹¹⁸Aは0.39、(⁵²⁷C-⁶⁶⁹G)-⁹⁸⁷G-¹¹¹⁸Cは0.61であった。MJD患者の染色体は(⁵²⁷T-⁶⁶⁹A)-⁹⁸⁷C-¹¹¹⁸Aのハプロタイプのみであった。このハプロタイプを持つ染色体は正常者においてもCAGリピート数の大きい領域に分布しており、CAGリピートが伸長した疾患染色体の起源となっているのではないかと推測される。

　1994年に染色体14q32.1に位置する原因遺伝子MJDが報告され、発症機序について様々な知見が報告されているが、遺伝子の構造、発現調節機能については未だ明らかではない。最も基礎となる遺伝子構造を明らかにすることを目的として研究を行った。

　遺伝子の発現を調べるために既知の配列をもとにcDNAをクローニングし、それをプローブにしてノザンブロット解析を行った。その結果、約1.4、1.8、4.5、7.5kbの大きさの少なくとも4種類の転写産物が存在し、MJDのは脳だけでなく全身臓器にubiquitousに発現することを明らかにした。完全長のcDNAをクローニングする目的で、ヒト脳、基底核、網膜、精巣由来の4種のcDNAライブラリーを計約5x10⁶pfuスクリーニングし、計27個のcDNAクローンを得た。このうち独立陽性クローンは21個であった。構造解析の結果、MJD1aと同じタイプのものを含め、cDNAクローンは後述の3つのタイプに分類された。

　MJDの発現調節領域を含むゲノム構造を解明するため、14番染色体のコスミドライブラリーから13個のクローンを、ヒトゲノムBACライブラリーから8個のクローンを得、FISH解析を行った。14q32.1に位置する6個のコスミドクローンおよび8個のBACクローンのfiber FISH、PCR法を用いた解析から、MJDを中心とする約300kbのコンティグを得た。また遺伝子上流域がセントロメア側であることを明らかにした。ほぼMJD全遺伝子をカバーしていると考えられる5個のコスミドおよびこれらを含み5’側約70kb上流までカバーするBACクローンB445M7についてネスティドデリーション法、ショットガン法による塩基配列の解析を行った。その結果MJDを含む14番染色体ゲノム塩基配列175,330bpを決定した。cDNAクローンとの比較、ESTデータベースの検索、RT-PCR解析から以下の点が明らかになった。(1)MJDは11のエクソンからなり約48kbの大きさの遺伝子である(図2)。(2)MJD1aはエクソン10を3’端とするmRNAのcDNAである。(3)エクソン11はエクソン10のエクンン内選択的スプライシングにより使用される。この転写産物に対応してMJD1aとは3’端の異なるcDNAが得られた。(4)選択的スプライシングにてエクソン2を含まない転写産物(翻訳フレームは維持)が存在する。これが第3のタイプのcDNAである。長さが短いなど上記に分類されないものを第4のタイプ(type4)とした。(5)エクソン11の3’非翻訳領域には7箇所のポリA付加シグナルが同定される。(6)cDNAクローニング、ゲノムシークエンシングの結果から、少なくとも約1.4,1.9,2,4.8,7kbの大きさの転写産物の存在が推測され、ノザンブロットの結果を説明しうる。(7)タンパクとしては2箇所の選択的スプライシングおよび3箇所の多型の相違により少なくとも5種類存在する。

図表図1:ハプロタイプ別CAGリピートの分布 図2:MJDのゲノム構造

　本研究において、MJDは本邦の常染色体性優性遺伝性脊髄小脳失調症の中では約3割を占める高頻度の疾患であることを示した。MJDと連鎖不平衡を呈する遺伝子内多型を新たに3箇所同定し、これらの多型を利用したハプロタイプ解析の結果、日本人集団ではハプロタイプは2種類であることを示した。日本人集団ではこの2種類のハプロタイプのうち、MJD染色体と同じハプロタイプ:(⁵²⁷T-⁶⁶⁹A)-⁹⁸⁷C-¹¹¹⁸Aを持つ正常染色体が疾患染色体の起源となっているのではないかと考えた。

　MJDについては、大きさ1776bpのcDNA:MJD1aが同定され、4つのエクソンからなると報告されていたが、ゲノム構造解析を行った結果、MJDは11のエクソンから構成され、約48kbの大きさであることを明らかにした。またMJDはubiquitousに発現し、選択的スプライシングおよび選択的ポリA付加により、約1.4〜7kbの複数の転写産物が存在すると推定された。

　本研究によって明らかにしたMJDのゲノム構造、MJDの起源となるハプロタイプの同定は、治療法の開発を含めた今後のMJD研究の礎になるものと考えられる。