p105CasLは、p130Casファミリーに属し、N末端に1つのSH3領域、中央部に基質領域と呼ばれる13の「YXXP」モチーフを含む領域、C末端にSrc SH2領域への結合能のある「YDYVHL」モチーフを持つドッキングタンパク質である。主にリンパ球と一部の上皮細胞に発現し、1インテグリンやT細胞レセプター、B細胞レセプターからの刺激によってリン酸化され、CrkLを介してMAPKの活性化や細胞運動の制御に関与すると考えられている。また、CasLは慢性骨髄性白血病の原因遺伝子であるbcr/abl遺伝子産物によって強くリン酸化されることが、動物モデルなどで確認されており、Bcr/Ablの腫瘍化シグナルにおいて重要な役割を果たしていることが予想されている。

　CasLをリン酸化する分子の一つに細胞質キナーゼの一つであるFAKが確認されているが、FAKはCasLのSH3領域を介して結合する。また、p130Casの場合はその他にPyk2/RAFTK、PTP-1B等数多くの分子がSH3領域を介して結合することが示されており、ドッキングタンパクとして機能する際のSH3領域の重要性が認識されている。

　この度私はリンパ球において重要なシグナル伝達に関与し、腫瘍化にも関連していると思われろこのCasL分子に注目し、CasL SH3領域に結合する分子をFar Westernスクリーニング法にて検索したところ、これまでに報告されていない新規の細胞質タンパク質を同定したので報告する。

　GST-CasL SH3領域融合タンパク質をプローブとして、正常ヒト胸腺由来の発現ライブラリをFar Western法にてスクリーニングしたところ、4種類の既知分子(FAK、PTP-1B、PTP-PEST、C3G)と1種類の未知クローンが得られ、未知クローンのスクリーニングを続けたところ、その全長を得た。この分子は、1067アミノ酸からなる分子量118kDaのタンパク質であり、アミノ酸配列から1つのLIMドメインと、1つのロイシンジッパー構造およびCalponin類似領域をもつことが分かった。また、Pro-Pro-Lys-Pro-Pro(PPKPP)という配列のプロリン豊富領域も認められる。後述のように、この新規分子はPPKPP配列にてCasL SH3領域と結合するため、私は本新規分子をCLIM(CasL Interacting Molecule/CasL interacting LIM domain)と命名した。データベース検索により、CLIMにはヒト脳由来ライブラリよりクローニングされたKIAA0750という類似分子が存在することが判明したが、KIAA0750の生物学的機能は未だ解析されていない。Northern解析にてCLIMは胸腺、肺、脾臓、精巣に強く発現していることが分かった。また、骨髄系、リンパ系の各種血液細胞株でも発現が多い。これらの発現組織はCasLの発現組織と重複するところが多く、両者の相互作用が示唆される。

　そこでCLIMとCasLが実際に結合することを示すため、まずCasL、p130Cas、CrkのSH3領域(CrkはN末端側SH3領域)とGSTの融合タンパクを作成し、これらとCLIMの結合実験を行った。その際抗体での検出を容易にするために、CLIMはそのC末端にFLAGタグを付加したものを実験に用いた。まずGST-SH3融合タンパクをグルタチオンセファロースビーズに結合させ、ここにCLIM-FLAGを発現させたCOS7細胞の全細胞抽出液を加えて反応させ、ビーズに結合したタンパク複合体をSDS-PAGE、ウェスタンブロットにて解析したところ、複合体中にCLIM-FLAGが含まれることが分かった。また、p130Casの場合そのSH3領域に結合するプロリン豊富領域のコンセンサス配列がPPKPPであり、CasL SH3領域の場合も同様であることが予想されたため、CLIMプロリン豊富領域のPPKPP配列をPPAPPに変化させた変異体(mCLIM-FLAG)を作成してCOS7細胞に発現させ、同様の実験を行ったところ複合体中にmCLIM-FLAGは認められなかった。以上より、CLIMとCasL SH3領域はCLIMのPPKPP配列を介して結合していることが明らかになった。

　次に細胞内でCLIMとCasLが結合していることを示すため、COS7細胞にCLIMおよびN末端にMycタグを付加たCasLを共発現させ、抗CLIM抗体、抗Myc抗体で免疫沈降し複合体中にそれぞれMyc-CasL、CLIMが含まれているかを検索した。これに先立ち、CLIMのC末端領域に対するウサギポリクローナル抗体を作成し、この抗体が免疫沈降可能であることを確認しておいた。その結果抗Myc抗体で免疫沈降した複合体中に抗CLIM抗体で検出できるCLIM分子が存在することが示され、両者の細胞内での結合が確認された。なお、抗CLIM抗体で免疫沈降した複合体中には抗Myc抗体で検出できるMyc-CasLを確認することはできなかった。その明らかな理由は不明だが、抗CLIM抗体が三次構造上CLIMとCasLの相互作用に必要な部分をブロックしている可能性、抗CLIM抗体の力価が低い可能性などが考えられた。

　さらに、CLIMおよびCasLの細胞内分布を確認するため、抗CLIM抗体、抗CasL抗体を用いて、蛍光免疫染色を行った。まず、両者を共に発現しているT細胞系細胞株であるH9細胞を用いて実験を行ったところ、CLIM、CasL共に細胞質領域が染色され、両者の存在領域は一致することが分かった。また、COS7細胞に両者を共発現させて同様の染色を行ったところ、やはり両者とも細胞質に分布し、分布領域はH9細胞の場合と同じく一致することが分かった。

　以上より、新規タンパク質CLIMは細胞質に分布し、そのプロリン豊富領域に含まれるPPKPP配列を介してCasL SH3領域と結合していることが判明した。CLIMはキナーゼなどの酵素活性部位は持たず、CasL同様に何らかのドッキングタンパク質であると考えられる。CLIMにはLIMドメインが存在するが、細胞質LIMドメイン保有分子には、Paxillin、Zyxin、Enigma等の細胞骨格関連分子があり、CLIMにはアクチン結合に関係するCalponin類似領域もあることから、CLIMがこれらと同様に細胞骨格制御に関与している可能性が予想される。また、CasLはT細胞受容体やB細胞受容体刺激によってリン酸化され、MAPKへとシグナルを伝達すると考えられており、さらにBcr/Ablのシグナル伝達にも関与している。CLIMがこれらのシグナル伝達系に関与していないか、リン酸化の検索などを通じてさらに研究を進めていく予定である。