ユビキチン(Ub)は分子量8.6kDaの進化的に高く保存された蛋白質であり新しい翻訳後修飾分子として作用する。UbはE1(活性化酵素)-E2(結合酵素)-E3(リガーゼ)の複合反応で様々な細胞内蛋白質に共有結合し、その繰り返し反応によって形成されたポリUb鎖(多数のUbの重合型)は"分解シグナル"となる。Ub化蛋白質はプロテアソーム(真核生物のATP依存性プロテアーゼ)の標的となって異化代謝され、最近、この選択的蛋白質分解が細胞周期、シグナル伝達、免疫応答など様々な生体反応の制御に中心的な役割を果たしていることが明確になってきつつある。興味深いことは、Ubが融合蛋白質として生合成されること、ポリUb鎖形成が可逆的であること、そしてプロテアソームでは分解されずに再利用されることなどであり、ごく最近Ubを生成・供給する酵素である脱ユビキチン化酵素(DUB)の生物学的重要性が生命科学の分野で広く認識され始めている。

　一方、臨床医学のレベルでは、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病など種々の神経変性疾患患者の脳においてポリUb化蛋白質が異常に蓄積している所見が数多く報告されている。このようにUb代謝の破綻が神経活動を抑圧しこれらの難治性疾患の発症誘因となっている可能性が示唆されており、特にUb代謝を調節する役割を担っているDUBの役割が注目されている。現在までに哺乳類のDUBとしては60種類以上の報告があるが、その詳細は不明である。そこで本研究では、臨床的に重要と考えられるウシ脳のDUB群の性状について生化学的に解析した。

　ウシ脳を試料としてホモジネートを調整した後、遠心分離分画法による分別や各種クロマトグラフィー操作を用いて複数のDUBを分離精製した。DUB活性は¹²⁵Iで標識したUb-NH-MHISPPEPESEEEEEHYC(Ub-PESTc)を基質として反応後に遊離してきた¹²⁵I-PESTcの定量およびSDS-PAGEによる解析から評価した。精製酵素の性状については、エドマン分解によるアミノ酸構造解析、免疫化学分析、および基質特異性などについて多角的に検討した。以下にDUB精製のフローチャートを示す。

図:ウシ脳からの脱ユビキチン化酵素(DUB)精製のフローチャート。横矢印は分離した各DUB。

　陰イオン交換カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、ヘパリンカラムによるクロマトグラフィー操作から、ウシ脳の可溶性分画には数十種類のDUBが存在する可能性が示唆された。さらにUbをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーによってsDUB-1、sDUB-2と名付けた分子量約30kDaの二種類の酵素を高純度に精製し、その性質を検討した結果、それらはヒトUCH-L3およびUCH-L1のウシホモログに相当すると推測された。

　一方、不溶性の膜画分にも可溶性分画に匹敵する¹²⁵I-Ub-PESTc分解活性を認めた。非イオン性界面活性剤の処理により可溶化した後、Ub-アフィニティークロマトグラフィーによってmDUB-1、mDUB-2と命名した酵素をほぼ均一に精製するとともに、各種クロマトグラフィー操作によってmDUB-3とmDUB-4と名付けた新しいDUBを部分精製した。

　精製した酵素標品のアミノ酸構造特性および阻害剤特異性や基質特異性の検討から、分離した6種類のDUB群が互いに異なる酵素であることが示唆された。これらの酵素は全て、UbのC末端に融合したペプチドを解離させるプロセシング活性を有していたが、mDUB-1とmDUB-3にはポリUb化させたp53からUb分子を解離させるアイソペプチダーゼ活性を持つことが観察された。以上の結果はウシ脳には機能の異なる多様なDUBが存在する可能性が考えられ、それらが脳におけるUb代謝の調節に関与している可能性が示唆された。

　本研究から、ウシ脳の可溶性分画には予想以上に多数のDUBの存在することが考えられた。また、今回初めて細胞内に膜結合型DUBの存在することが判明した。これらの結果から、可溶性蛋白質のみならず膜結合蛋白質のUb化修飾も可逆的であることが推定された。このようにDUBが大きなファミリー蛋白質として存在することは、Ub前駆体のプロセシング反応およびUb修飾システムの可逆性が生理学的に重要な意味を持っていることを示唆している。事実、DUBが長期記憶や細胞分化に関与することの他に、癌および脳神経変性疾患におけるUb代謝の異常などが多数報告されている。このようにDUBの分子多様性は、Ub化修飾系の機能が多岐にわたっており、その可逆性の制御が生理的に重要な役割を担っていることを示唆している。しかし、高等動物におけるDUBの概要は未だほとんど解明されていないのが現状である。今後、個々のDUBの分子特性と生物学的作用の解明は、増加の一途を辿っているUb研究に新しい方向性を提示する可能性を与える事になるかもしれない。更に、DUBの異常に基づいた様々な疾患の発症や防御のメカニズムの研究に重要な役割を果たすことも期待されている。