アラキドン酸の代謝産物であるプロスタグランジンD₂(PGD₂)は、PGG₂/PGH₂を基質としてPGD₂合成酵素により作られ、PGJ₂、¹²-PGJ₂,15-deoxy-^12,14-PGJ₂(15d-J₂)へと代謝される。その生理的作用は、脳における神経伝達物質としての役割が報告されてきた。心臓血管系ではアデニル酸シクラーゼの活性化を介して血小板の凝集能を抑制し、血管拡張作用を有する。また、血小板、マクロファージ、肥満細胞といったアテローム性動脈硬化病巣の構成細胞でもPGD₂が産生されているとの報告があり、血管系でのPGD₂役割も注目されている。最近、細胞内にperoxisome proliferator-activated receptor(PPAR)という核内レセプターが存在し、そのタイプにPGD₂の代謝産物である15d-J₂がリガンドとして作用することが明らかにされた。これは、PGD₂系の新しい細胞内作用メカニズムの存在を示唆する。これらより、PGD₂は細胞内、外のメカニズムを介して、心血管系障害の進展退縮に関与していると考えられる。

　一方、一酸化窒素(NO)はL-アルギニンを基質としてNO合成酵素(NOS)により合成され、抵抗血管の拡張作用を有し、心血管系障害の進展退縮のメカニズムに関与する。NOSには3種類のアイソフォームがクローニングされているが、誘導型NOS(iNOS)は生理的状態では発現しておらず、炎症性サイトカインなどにより誘導され発現する。iNOSにより産生されるNOは大量で、血管壁構成細胞に対し障害性に作用する。実際、動脈硬化病巣に浸潤したマクロファージなどは種々のサイトカインを分泌しiNOSを発現し、大量のNOを分泌して血管障害性に働く。また、動脈硬化巣では血管平滑筋細胞自体がiNOS mRNA発現によるNO産生の主要な場となる。

　ところが、これまでPGD₂とNO産生系のクロストークに関する報告は無かった。こうした背景をもとに、PGD₂の新たなる作用メカニズム、役割を解明する為に、PGDS遺伝子を血管平滑筋細胞、血管内皮細胞に導入し、内因性PGD₂産生を刺激することにより、iNOSによるNO産生をはじめとする種々め血管障害因子への影響を検討した。

　(1)6週齢Wistar系雄ラット胸部大動脈からexplant法により血管平滑筋培養細胞(VSMC)を作成し、ウシ頚動脈より血管内皮培養細胞(EC)を作成した。VSMCに20U/mLのIL-1を添加し、NO産生を刺激した後、外因性PGD₂、及び15d-J₂、PGI₂ analogueを添加し、24時間インキュベートし、上澄みと細胞を回収した。

　(2)3kbのPGDS(lipocalin type)遺伝子を、SV40 promoterを持つpcD2 plasmid vectorにライゲーションし、このPGDS発現ベクターをエレクトロポレーション(EP)法で培養細胞に導入した。24時間後アラキドン酸(10^-6mole/L)を加え、内因性PGD2産生を24時間刺激した後、20U/mLのインターロイキン-1(IL-1)を添加して18時間培養し、新鮮培養液に交換して2時間後上澄みと細胞を回収した。NO産生に関する実験ではVSMCを、plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)及びエンドセリン(ET)産生に関する実験ではECを用いた。

　(3)抗PGD₂抗体前処置にて外因性PGD₂を中和させPGDS遺伝子導入による内因性PGD₂のみの作用を観察した。

　(4)遺伝子導入効率は-galassayで確認した。エイコサノイドは放射免疫測定法、一酸化窒素はGriess法、PAI-1はenzymeimmunoassay法、ETはenzyme-linked immunosorbent assay法、mRNAの発現はreverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)法で測定した。mRNA発現の定量はcompetitive RT-PCR法で行った。蛋白合成はWestern blot法で確認した。すべての値は平均値±SEで示し、統計上の有意差はone-way ANOVAで評価した。P値0.01以下を統計的に有意と考えた。

　IL-1刺激を行ったVSMCでのNO産生量は10_-7〜10_-5mol/Lの外因性PGD₂あるいは15d-J₂の添加により、用量依存的に抑制され、PGI₂ analogue添加により軽度増加した。transporter遺伝子だけを導入した(コントロール)VSMCではPGD₂産生量は22.65±0.91pg/2hoursと低値であった。PGDS遺伝子を導入したVSMCでは、182%と著明にPGD₂産生量が増加した(遺伝子導入効率は18.3±1.2%)。培養液中に10^-6mol/Lのアラキドン酸を添加すると、PGDS遺伝子を導入したVSMCでは、著明にPGD₂産生量が増加した。コントロールVSMCとPGDS遺伝子を導入したVSMCの間で、PGI₂産生量には有意差は認めなかった。VSMCのNO産生量は、IL-1での刺激により有意に増加した。さらに、PGDS遺伝子導入し10^-6mol/Lのアラキドン酸にて内因性PGD2合成能を刺激したVSMCでは、コントロールと比べNO産生量が19%抑制された。また、PGDS遺伝子を導入し10^-6mol/Lのアラキドン酸で内因性PGD2合成能を刺激した後、外因性PGD2を抗PGD2抗体で中和しても、NO産生は抑制されたままであった。一方、20U/mLのIL-1刺激を行ったVSMCではiNOS mRNAの発現、iNOS蛋白合成が顕著に認められたが、それはPGDS遺伝子導入により有意に抑制された。さらに、iNOS mRNAの定量によりこのiNOS mRNAの発現抑制幅は約25%と考えられた。

　20U/mLのIL-1刺激によってECにおけるPAI-1産生およびエンドセリン産生は有意に増加した。これらの増加は、PGDS遺伝子導入により有意に抑制された。また、このECにおけるPAI-1産生抑制は、PAI-1 mRNA発現抑制に起因することが示された。

　ラットVSMCに外因性PGD₂、あるいは15d-J₂を添加したところ、サイトカイン刺激によるNO産生が用量依存的に抑制された。ところが、これまで考えられていた細胞膜のPGD₂レセプターを介するアデニル酸シクラーゼ活性化とそれに基づくcyclic AMP増加の機序からは、外因性のPGD₂はiNOS mRNAの発現およびそれによるNO産生を増加させる方向に働くと考えられる。そこで、我々は細胞膜PGD₂レセプター作動性メカニズム以外にPGD₂の抑制機序があることを想定した。実際細胞内にPPARという核内レセプターが存在し、そのタイプのレセプターにPGD2の代謝産物である15d-J₂がリガンドとして作用することが最近明らかにされた。心血管系の構成細胞でも、この核内レセプターを介した細胞内機序により、PGD₂あるいはPGD2代謝産物が種々の機能を果たしている可能性がある。その解明のため、PGDS遺伝子を血管壁構成細胞に導入し内因性PGD₂の産生増加を試みた。PGDS遺伝子を導入したVSMCでの内因性PGD₂産生量が有意に増加した。また、PGDSの遺伝子導入を行ったVSMCではIL-1刺激によるiNOS mRNA発現、iNOS蛋白合成及びNO産生量は、コントロール細胞に比べ有意に低値を示した。さらに細胞外に分泌されたPGD₂を抗PGD₂抗体で中和しても、IL-1刺激によるNO産生は抑制された。よってNO産生の抑制は、PGD₂の細胞内メカニズムを介して起る現象であると考えられた。IL-1で誘導したiNOSmRNAの発現は、PGDS遺伝子導入したVSMCではコントロールに比べ有意に抑制され、competitive RT-PCR法で定量性を検証したところ、約25%抑制されていた。これらより、PGD₂あるいはその代謝産物は細胞内の機序を介してiNOS mRNAの発現を抑制し、その結果、NO産生を抑制することが判明した。

　また、新しく明らかになった核内レセプターを介するPGD₂の作用機序に関連して、他の血管障害因子に対しても内因性PGD₂の影響を検討した。IL-1刺激によりECでのPAI-1合成は有意に増加したが、PGDS遺伝子導入による内因性PGD2産生刺激を行ったところ、有意に抑制された。これより、内因性PGD₂は線溶系を亢進させ、血栓形成を防ぐ方向に作用すると考えられる。また、ECでのET-1産生も、PGDS遺伝子導入による内因性PGD₂合成刺激により有意に抑制された。これらのin vitroでの結果より、生体内においてもPGD₂あるいはその代謝産物は線溶系を亢進させ、ET-1産生を抑制することで、動脈硬化巣や血管収縮性の臓器虚血状態などで、その病態を改善する方向に働く可能性が考えられる。

　PGDS遺伝子導入により血管壁構成細胞における内因性PGD₂産生が増加し、細胞内メカニズムを介した内因性PGD₂の血管障害因子抑制作用が示された。PGDS遺伝子導入による内因性PGD₂の増加は、血管障害因子の産生抑制を介して血管壁保護性に働くと考えられ、臨床応用への可能性が示された。